Штамм бактерии escherichia coli-продуцент специфического днк-зонда, используемого для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов corynebacterium diphtheriae и комплементарного tox*99+ гену, определяющему синтез дифтерийного токсина

 

Использование: диагностика инфекционных заболеваний методом гибридизации нуклеиновых кислот. Сущность изобретения: получение штамма Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pABC124toxAB')-продуцента специфического ДНК-зонда для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae. Штамм обеспечивает высокий выход плазмидной ДНК pABC124toxAB', которая используется при ДНК-ДНК гибридизации в качестве специфического зонда.

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской микробиологии.

Известно, что при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний применяется метод ДНК-ДНК гибридизации, заключающийся в определении в исследуемом материале специфических последовательностей нуклеиновых кислот с помощью комплементарных этим последовательностям ДНК зондов (11). Метод ДНК-ДНК гибридизации со специфическими ДНК зондами сокращает время идентификации требовательных микроорганизмов, позволяет обнаруживать патогенные микроорганизмы непосредственно в клиническом материале и снижает себестоимость лабораторной диагностики инфекционных заболеваний. В зарубежной литературе имеются сведения об использовании нативных и химерных молекул ДНК или их фрагментов, часть которых представляет специфическую для tox⁺ гена дифтерийного токсина последовательность оснований, в качестве ДНК зондов при научных исследованиях [9,10] В нашей стране при конструировании штаммов-продуцентов иммунотоксинов были созданы химерные репликоны, которые были использованы или могли быть использованы как ДНК зонды при идентификации токсигенных штаммов С.diphtheriae [4,5,3] Однако редкие примеры использования химерных репликонов, несущих специфические последовательности гена дифтерийного токсина, в качестве ДНК зондов также не выходили за рамки научных исследований в основном была показана принципиальная возможность использования метода ДНК-ДНК гибридизации для выявления токсигенных штаммов С.diphtheriae [1,2] Во всех известных случаях применения нативных и химерных молекул как ДНК зондов не были определены специфические параметры (чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов) специализированного метода ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов С.diphtheriae, что не позволяло широко использовать этот метод, а следовательно те или иные ДНК зонды, при диагностических исследованиях.

Целью изобретения является штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pABC124toxAB') продуцент специфического ДНК зонда.

Штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pABC124toxAB') депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов. Справка о депонировании прилагается. Регистрационный номер 230.

Получение штамма. Штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pABC124toxAB') получен в результате СА²⁺-зависимой трансформации бактериальных клеток штамма Escherichia coli C₆₀₀thri leu6 thil supE44 LacYI tonA r^-m^{- -} F^- изолированной ДНК плазмиды pABC124toxAB'по незначительно модифицированному методу Mandel и Higa [8] Селекция трансформантов проведена по устойчивости к ампициллину на полноценной питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина; очистка трансформантов - три последовательных субкультивирования на той же среде. Плазмида, выделенная из устойчивых к ампициллину трансформантов, имела ту же электрофоретическую подвижность, что и исходная плазмида, то же электрофоретический рисунок при электрофорезе в агарозном геле BamH I рестриктов и давала положительный гибридизационный сигнал при ДНК-ДНК гибридизации с ДНК токсигенного штамма С.diphtheriae 665.

Характеристика штамма. Штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pABC124toxAB') имеет следующие характеристики. Штамм растет на полноценной питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Штамм растет на минимальной питательной среде, содержащей 100 мкг/мл треонина, 100 мкг/мл лейцина, 1 мкг/мл тиамина и 50 мкг/мл ампициллина. Штамм не ферментирует лактозу. Штамм обеспечивает стабильность молекулы химерного репликона плазмида pABC124toxAB', высокий выход плазмидной ДНК при выделении ее методом щелочного лизиса и возможность использования изолированной плазмидной ДНК при ДНК-ДНК гибридизации в качестве специфического ДНК зонда и при Ca²⁺-зависимой трансформации без дополнительной очистки в градиенте хлористого цезия бромистого этидия. Плазмида pABC124toxAB' стабильна в штамме Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pАВС124toxAB') при культивировании его на средах, содержащих 50 мкг/мл ампициллина, и элиминируется из бактериальных клеток этого штамма при культивировании его на средах, не содержащих ампициллин. На плазмиде pABC124toxAB' локализован ген устойчивости к ампициллину. Рестриктаза BamH I расщепляет плазмиду pABC124toxAB' на два фрагмента, меньший из которых, в основном, представляет специфическую последовательность оснований структурных генов дифтерийного токсина toxA и toxB. Тотальный препарат ДНК штамма Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pABC124toxAB'), плазмидная ДНК и меньший по размерам BAmH I фрагмент плазмидной ДНК дают положительный гибридизационный сигнал при ДНК-ДНК гибридизации с ДНК токсигенного штамма C.diphtheriae 665.

При выделении ДНК плазмиды pABC124toxAB'-специфического ДНК зонда для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphteriae штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m_- (pABC124toxAB') выращивают в полноценной жидкой питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при 37^oС в течение 18-20 ч. Бактериальные клетки осаждают и отмывают центрифугированием; плазмидную ДНК выделяют методом щелочного лизиса с последующей обработкой неочищенного препарата плазмидной ДНК хлористым литием (конечная концентрация 3М), рибонуклеазой (конечная концентрация 25 мкг/мл), протеиназой Т (конечная концентрация 1 мг/мл), депротеинизацией фенолом, смесью фенол-хлороформ и хлороформом и переосаждением этиловым спиртом [6] Выделенную плазмидную ДНК фрагментируют рестриктазой BamH I в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя фермента, и тотальный препарат плазмидной ДНК метят радиоактивной меткой методом рассеянной затравки с целью получения специфического радиоактивного ДНК зонда [7] Параметры (чувствительность, специфичность, прогностические значения положительных и отрицательных результатов), позволяющие использовать при диагностических исследованиях специализированный метод ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphtheriae, при котором меченные радиоактивным изотопом препараты ДНК плазмиды pABC124toxAB'. Escherichiae coli C₆₀₀r^-m^- применяются как специфический радиоактивный ДНК зонд, были установлены при сравнительной оценке настоящего метода ДНК-ДНК гибридизации и традиционного метода выявления токсигенных штаммов реакции преципитации в агаре. Обоими методами были изучены 134 токсигенных и 125 нетоксигенных штаммов С. diphtheriae, выделенных на территории России, преимущественно во Владимирской и Пензенской областях, за период с 1986 по 1989 гг. При проведении ДНК-ДНК гибридизации бактериальные клетки изучаемых штаммов лизировали лизоцином (конечная концентрация 2 мг/мл) и додецилсульфатом натрия (конечная концентрация 1%). Лизаты бактериальных клеток последовательно обрабатывали протеиназой Т (конечная концентрация 1 мг/мл), ацетатом натрия (конечная концентрация 0,3 М), ДНК переосаждали этиловым спиртом [6] Пробы наносили на нейлоновой мембранный фильтр; обработку фильтров, ДНК-ДНК гибридизацию на мембранных фильтрах и авторадиографию проводили по модифицированному методу Бобкова с соавторами (1988) [2] Было показано, что при замене в традиционной технологии бактериологического анализа метода преципитации в агаре методом ДНК-ДНК гибридизации параметры, характеризующие настоящий метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pABC124toxAB', Escherichia coli C₆₀₀r^-m^-, а именно чувствительность, специфичность, прогностические значения положительных и отрицательных результатов, были соответственно равны 97, 87, 90 и 98% в случае, если слабый гибридизационный сигнал расценивается как положительный, и 97, 98% в случае, если слабый гибридизационный сигнал расценивается как отрицательный. В отличие от реакции преципитации в агаре, метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pABC124toxAB'. Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- позволил выявить штаммы C.diphtheriae с дефектным геном дифтерийного токсина, то есть штаммы, не продуцирующие дифтерийный токсин. Таким образом, метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pABC124toxAB'. Echerichia coli C₆₀₀r^-m^- может быть использован не только при диагностических исследованиях, но и при наблюдениях за миграцией tox⁺ гена, детерминирующего синтез дифтерийного токсина и/или его фрагментов в популяциях C.diphtheriae.

Литература: 1. Бобкова М.Р. Маркина С.С. Мазурова И.К. Бобков А.Ф. Гараев М.М. Тезисы докладов 1-й Всесоюзной конференции "Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза" 1-2 октября, 1985 г. г. Москва. стр.3-4.

2. Бобков А.Ф. Бобкова М.Р. Гараев М.М. Комбарова С.Ю. Мазурова И.К. Маркина С.С. Авт. свидетельство N 4406330/30-13 от 21 марта 1988 г.

3. Гараев М. М. Бобкова М.Р. Бобков А.Ф. Лукашевич Н.В. Казенкова Е.В. "Генетика", 1990, N 6, стр. 990-999.

4. Здановский А.Г. Здановская М.В. Зайцев Е.М. Свиридов В.В. Якубович Н. В. Ребентиш Б.А. Янковский Н.К. Молек.биол. 1988, т.22, N 5, стр. 1293-1300.

5. Ковган А.А. Жданов В.М. МЭИ, 1988, N 8, стр. 23-31.

6. "Плазмиды", под редакцией Харди К. Москва, "Мир", 1990.

7. Feinberg A.P. Vogelstein B. Anal. Biochem. 1984, v. 137, p. 266-267.

8. Mandel M. Higa A. J. Mol. Biol. 1970, v.53, p. 154.

9. Papenheimer A.M. Murphy J.R. The Lancet, 1983, v.2, p. 923-926.

10. Rappuoli R. Perugini M. Falsen E. The New England Journal of Medicine, 1988, v. 318, p. 12-14.

11. Tenover F.C. Clinical Microbiology Reviews, 1988, v. 1, p. 82-101.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli N 230 (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) - продуцент специфического ДНК-зонда, используемого для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae и комплементарного tox⁺ гену, определяющему синтез дифтерийного токсина.