Соли гликозаминогликанов и гликозаминогликаны

 

Использование: в медицине, так как обладают терапевтическими свойствами. Сущность изобретения: продукт - гликозамогликаны или их соли ф-лы I где А - NR₁, R₂ или R₁ R₂ R₇ N(+), B-NR₃R₄ или N(+) R₃ R₄ R₈; R₁, R₂, R₃, R₄ - C₁-C₁₈-алкил, или R₁ и R₂, а также R₃ и R₄ вместе с атомом азота образуют пиперидил; R₅ и R₆ - Н или С₁-С₄-алкил; R₇ и R₈ - Н, m = n = 1 - 4, Х означает -O-С(O)-O-. Реагент 1: аминоспирт. Реагент 2: фосген. Условия реакции: молярное соотношение реагентов 2:1 в инертном растворителе при 10 - 30^oC. 2 с. и 3 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к солям гликозаминогликана, способным создавать терапевтически эффективные уровни гликозаминогликанового полианиона в крови даже при пероральном или ректальном назначении.

Протеогликаны представляют собой макромолекулы, отличающиеся наличием протеинового ядра, с которым ковалентно связаны различные полисахариды. Они отличаются по характеру протеинов и характеру сахаридных боковых цепей и представляют собой основную часть некоторых тканей млекопитающих.

С помощью соответствующих гидролитических методов (например, посредством протеаз) можно отделить протеиновую часть от сахаридных частей, обычно именуемых гликозаминогликанами, вследствие их наличия в аминосахарах.

Гликозаминогликаны, известные под названием хондроитин-4- или 6-сульфат, гепаран сульфат, гепарин, дерматан сульфат, гиалуроновая кислота и т.д. характеризуемые в каждом отдельном случае полидисперсностью молекулярного веса, а также гетерогенностью сахаридных композиций, получают таким образом, а также промышленно.

Благодаря высоко гидрофильному полианионному характеру, гликозаминогликаны могут взаимодействовать с различными химическими веществами, например, с двухвалентными катионами или с плазменными основными протеинами часто неспецифично, а иногда (например, в случае комплекса гепарин-анти-тромбин III или комплекса дерматан сульфат-кофактор III) с определенной специфичностью, степень которой выше или ниже в зависимости от лиганда или от связывающего средства.

Имеют место также взаимодействия с химическими веществами, связанными со структурами клеточных мембран, например со структурами, составляющими кровеносные сосуды.

Благодаря указанным взаимодействиям, гликозаминогликаны представляют собой интересные терапевтические средства, поскольку они позволяют контролировать патологические состояния, при которых широко используют либо активацию, либо ингибирование некоторых факторов плазмы (например, анти-тромбина III или активированного фактора Х).

Гликозаминогликанами, используемыми для получения солей изобретения, являются следующие: нефракционированный гепарин, независимо от природы экстрагируемого сырья (свиная бычья или овечья кишечная слизистая оболочка, легкое и т.д.) и от способов экстракции и очистки; гепариновые фракции и фрагменты любого молекулярного веса и величины заряда аниона, независимо от способов получения и выделения; вышеуказанные гепарины, фракции или фрагменты, подвергнутые процессам сульфатирования ("сверхсульфатированные").

дерматан сульфат, его фрагменты или фракции, также сверхсульфатированные; гепаран сульфат, его фрагменты или фракции, также сверхсульфатированные; модифицированные гепарины различного молекулярного веса, получаемые N-десульфатированием (10 100) гепаринов, а затем подвергаемые полусукцинилированию.

Гепарин экстрагируют из тканей различного происхождения: бычья или свиная кишечная слизистая оболочка, легкое и т.д. В химическом отношении гепарин, а также его фракции или фрагменты представляют собой смесь, имеющую полидисперсный молекулярный вес 1000 30000 Д.

С биологической точки зрения сам гепарин, его фрагменты и фракции проявляют различные фармакологические активности, в частности антикоагуляционную, анти-тромботическую, антиангиогенетическую и антилипемическую активности. Указанные активности связаны со способностью к развивающимся взаимодействиям с различными факторами, либо плазменными, либо сверхплазменными (антитромбин III, активированный фактор Х, кофактор II гепарина, активатор плазминогена, липопротеинлипаза в сочетании с факторами тромбоцита). В соответствии с использованием гепарина самого по себе или его фрагментов или фракций (имеющих низкий молекулярный вес 3500-9000 Д), один механизм действия может возобладать над другим, или может получиться более или менее длительная фармакокинетика.

Солями этих полианионов, наиболее часто используемыми в терапии человека, являются соли натрия, кальция или магния.

Дерматан сульфат можно получить из тканей млекопитающих, например, кожи, кишок, сухожилий и т.д. с помощью ферментативного и контролируемого химического гидролиза.

Он также известен под названием хондроитин сульфат В и проявляет анти-тромботическую активность, не связанную с антикоагуляционной, так что его можно считать терапевтическим средством, более безопасным по сравнению с гепарином. Анти-тромботическая активность, по-видимому, обусловлена способностью катализирования взаимодействия между кофактором III гепарина и тромбином и дезактивацией последнего в результате взаимодействия.

Используемыми солями для указанного полианиона также являются соли натрия и кальция.

Гепарин сульфат можно получить из соединительных тканей, например, легких, базальных мембран, стенок кровеносных сосудов, поджелудочной железы и т.д.

Он оказывает положительное анти-тромботическое действие in vivo, даже если проявляет слабые фармакологические активности in vitro. Для указанного полианиона используемой солью также является неорганическая соль, например, соли натрия, кальция или магния.

Особым семейством гликозаминогликанов является семейство "сверхсульфатированных" производных, получаемых сульфатированием вышеуказанных различных продуктов, имеющих или не имеющих низкий молекулярный вес (ЕР 116801). Указанные производные обладают низкой антикоагуляционной активностью, средней анти-Ха активностью и анти-тромботической активностью, сравнимой с активностью исходного гликозаминогликана. В этом случае используемой формой также является соль натрия или кальция.

Другим семейством химически модифицированных гликозаминогликанов является семейство, получаемое с помощью контролируемого N-десульфатирования (с более или менее высокими степенями N-десульфатирования) и последовательного сукцинилирования (Патент Италии N 1.140.999 и 1.169.888; Патент США N 3.118.816).

Указанные производные в форме солей натрия или кальция проявляют пониженную антикоагуляционную активность и хорошие липаземическую и анти-тромботическую активности.

Неорганические соли вышеупомянутых гликозаминогликанов могут быть назначены в виде соответствующих композиция с помощью общих способов применения (внутривенно, путем вливания, подкожно и т.д.) подопытным животным и людям, оказывая заметное анти-тромботическое действие (особенно венозное), которое не наблюдают при осуществлении их назначения пероральным путем, вследствие недостаточной биологической доступности активных элементов.

Указанная недостаточная абсорбция при пероральном назначении влечет за собой значительное ограничение для профилактической терапии, осуществляемой в течение длительного времени.

Для того, чтобы преодолеть этот недостаток за недавние годы были применены различные подходы: с помощью использования неорганических солей в соответствующих фармацевтических композициях, включающих в себя различные существа (заявка Италии 22010 (А) 82; Патент Японии N 0054-313; ЕР-А-130550; ДЕ А-3.331.009; Патент США N 4.6,4.376), или с помощью образования комплексов (Патент США N 4.654.327; Патент США N 4.478.822; Патент США N 4.510.135), состоящих из аммониевых производных сополимеров этилен оксида и пропилен оксида или триглицеридов; или с помощью образования "ионных мультиплетов", состоящих из амина или четвертичных аммониевых производных полиспиртов (РСТ/ U.S. 85/00846).

Однако в настоящее время в распоряжении промышленности не имеется ни оральных, ни ректальных композиций, содержащих гликозаминогликаны, для терапии тромбоза.

Обнаружено, что при использовании в качестве солеобразующих оснований вместо натрия или кальция органических катионов особого химического состава фармакологические свойства, типичные для указанных гликозаминогликанов при парентеральном назначении, сохраняются, когда органические соли изобретения назначают перорально или ректально. Этот эффект также наблюдают, когда соли получают, подвергая гликозаминогликановую кислоту солеобразованию с вышеуказанными органическими основаниями лишь частично, причем остающиеся кислотные группы находятся в виде неорганических солей (натрия, кальция, магния и т. д. ). Органические катионы, используемые в соответствии с изобретением, имеют общую формулу I где R₁, R₂, R₃ и R₄, одинаковые или различные, представляют собой водород; линейный или разветвленный алкил; циклоалкил; аралкил; или
R₁ и R₂, соответственно R₃ и R₄, наряду с атомом азота, с которым они связаны, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, возможно содержащее другие гетеро-атомы;
R₅ и R₆ одинаковые или различные, представляют собой водород, С₁-С₄ алкил или арил;
R₇ и R₈, одинаковые или различные, представляют собой водород или С₁-С₄ алкил;
, одинаковые или различные, представляют собой целые числа от 1 до 4 включительно;
Х представляет собой одну из следующих групп:

где R₉ и R₁₀ представляют собой водород или С₁-С₄ алкил, тогда как p представляет собой целое число от 1 до 6 включительно; q представляет собой целое число от 1 до 4 включительно; r представляет собой целое число от 1 до 5 включительно.

Изобретение также относится к соответствующим основаниям катионов формулы I, которые являются новыми (известные соединения, включенные в вышеприведенную формулу и описанные в ЕР-А-17623, GB-A-2126579, FR-A-2021042 были отвергнуты), а также к их солям, образованным взаимодействием с неорганическими или органическими кислотами (такими, например, как галогенводородная, серная, фосфорная, угольная, азотная, муравьиная, уксусная, щавелевая, малеиновая, лимонная, винная кислоты), к способам получения солей катионов I с гликозаминогликановыми полианионами; к фармацевтическим композициям, содержащим одну или более солей гликозаминогликанов с катионами формулы I.

В соответствии с изобретением основания формулы Ia

где R₁-R₆, Х, имеют вышеупомянутые значения, соответствующие катионам формулы I, в которых R₇ R₈ водород, получают с помощью способов, традиционно используемых для получения диалкилкарбонатов, эфиров карбоновых кислот, мочевин, карбаматов, эфиров дикарбоновых кислот или эфиров диолов, диамидов, эфир-амидов и т.п. В частности в тех случаях, где Х представляет собой -О-СО-О-, R₁=R₃ и R₂=R₄ (т.е. R₁ и R₂, соответственно, R₃ и R₄ образуют наряду с соответствующим атомом азота два равных гетероциклических кольца), соответствующие аминоспирты взаимодействуют с фосгеном в молярном отношении 2: 1 в инертных растворителях, например, аренах или простых эфирах или галогенированных углеводородах при (-10) (+30)^oC, предпочтительно при около 0^oC. Реакционную смесь встряхивают с водным раствором гидрокарбоната или карбоната натрия или калия, достаточным для нейтрализации образованной соляной кислоты; органическую фазу сушат и выпаривают досуха.

Получаемые продукты, обычно в виде масел, необязательно очищают с помощью хроматографии. Или же фосген можно заменить N,N'-карбонил-диимидозолом; в этом случае взаимодействие осуществляют в присутствии небольших количеств аминоалкоксида натрия, предварительно полученного путем взаимодействия металлического натрия с аминоспиртом при 0 50^oC, предпочтительно при комнатной температуре. В этом случае продукт выделяют только с помощью промывания органического раствора водой.

Наоборот, при , аминоспирт

где R₁, R₂, R₅ имеют вышеуказанные значения, взаимодействует с активным производным , -ненасыщенной кислоты, например, с хлоридом или ангидридом, с получением соответствующего a, -ненасыщенного аминоалкилэфира. Взаимодействие соответственно осуществляют в инертных растворителях (галогенированных углеводородах, аренах, простых эфирах) и в присутствии третичного основания (триэтиламин, пиридин) в качестве связывающего кислоту средства. Получающийся амин взаимодействует затем с избытком амина R₃R₄NH при 0 40^oС, предпочтительно при комнатной температуре, с получением продукта присоединения указанного амина к активной двойной связи.

Выделение осуществляют в соответствии с известным способом.

В том случае, если Х снова представляет собой -О-СО-группу и n 1, сначала диалкиламин R₁R₂NH взаимодействует с альдегидом R₅-СНО в присутствии карбоната калия в водной среде и при комнатной температуре. Продукт реакции (R₁R₂NH-chr₅-OH) экстрагируют несмешивающимся с водой растворителем, и он взаимодействует с аминокислотой формулы

в присутствии дициклогексилкарбодиимида и пиридина при 0 50^oC, предпочтительно при комнатной температуре. Дициклогексилмочевину отфильтровывают, затем продукт выделяют, выпаривая растворитель, и при необходимости очищают с помощью хроматографии.

Когда в общей формуле Ia Х представляет собой группу -NH-CO-, а выше 1, диамин R₁R₂N-(chr₅)_n-NH₂ ацилируют хлоридом , -ненасыщенной кислоты или смешанным ангидридом; полученный амид затем обрабатывают избытком амина R₃R₄NH, который присоединяется к активной двойной связи. Эти две процедуры можно поменять местами. Условия реакции аналогичны вышеуказанным.

При способ осуществляют аналогично уже указанному для оснований Ia, в которых , причем единственное отличие состоит в использовании диамино вместо аминоспиртов. Аналогично осуществляют реакцию с получением соединений Ia, в которых соответствующий диалкиламино-алкиламинокарбонил хлорид взаимодействует с соответствующим диалкиламиноспиртом.

Соединения Ia, в которых или , напротив, получают взаимодействием соответствующих аминоспиртов (соответственно, соответствующих диаминов) с активными производными алкандикислот при обычно используемых условиях.

Соединения, в которых Х представляет собой группу, где R₉ и p имеют вышеупомянутые значения, можно получить из соответствующих диодов или из активных производных соответствующих аминокарбоновых кислот при обычных для такого рода реакций условиях.

Катионы формулы I, в которых R₇ и R₈ представляют собой С₁-C₄ алкил, получают соответственно взаимодействием соответствующих оснований Ia с соединениями формулы R₇-Y (R₈-Y), в которых Y представляет собой отщепляющуюся группу, например, хлор, бром, иод, метилсульфонилокси, толуолсульфонилокси.

Вышеописанные способы можно без особых трудностей применить к интермедиатам вида

где R₇ и R₈ представляют собой не водород, а А представляет собой защищенную гидрокси или аминогруппу.

Соли гликозаминогликановых полианионов и катионов формулы Ia в соответствии с изобретением можно получить:
а) подвергая водные растворы натриевых и кальциевых солей гликозаминогликана хроматографии на смолах при Т < 7^oC с тем, чтобы частично или полностью удалить ионы натрия и кальция. Элюаты обрабатывают либо основаниями Ia, либо гидроксидами катионов I, в которых R₇ и R₈ представляют собой С₁-С₄ алкил, в желаемом стехиометрическом соотношении, получая либо "нейтральные" соли, либо соли, все еще содержащие избыток аниона, который возможно может быть нейтрализован различными катионами, либо избыток катиона, который может быть нейтрализован различными анионами;
б) подвергая диафильтрации водные растворы натриевых солей гликозамингликанов и солей катионов формулы I с неорганическими кислотами, в частности галогенводородными кислотами.

В обоих случаях конечную соль выделяют соответственно сушкой замораживанием.

В последующих примерах были использованы следующие гликозаминогликаны и их производные и следующие испытания:
1. Гликозаминогликаны (ГАГ):
1.1. Гепарин натрия, свиной, молекулярного веса около 13500 Д.Анти-Ха активность: 175 ед./мг (хромогенов). Анти-коагуляционная активность: 170 I. U./мг (Продукт Р2).

1.2. Низкомолекулярный гепарин, натриевая соль, средний молекулярный вес около 4000 Д.Анти-Ха активности: 95 ед./мг (хромогенов). Анти-коагуляционная активность: 58 I.U./мг (Продукт Р2).

1.3. Дерматан сульфат натрия, средний молекулярный вес около 20000 Д.Анти-коагуляционная активность: 45 I.U./мг (Продукт Р3).

1.4. Гепарат сульфат натрия, средний молекулярный вес около 18500 Д.Анти-Ха активность: 763 ед./мг (хромогенов). Анти-коагуляционная активность: 20 I.U./мг (Продукт Р4).

1.5. Сверхсульфатированные фрагменты гепарина, получаемые в соответствии с процитированным выше Е.Р.N.116801. Средний молекулярный вес около 6000 Д. Анти-Ха активность: 60 ед./мг (хромогенов). Анти-коагуляционная активность: 15 I.U./мг (Продукт Р5).

Использование ГАГ, имеющих вышеописанные химико-физические и биологические характеристики для иллюстрации изобретения не должно предполагать ограничения обоснованности самого изобретения, которое также относится к тем ГАГ, имеющим различные молекулярные веса, солеобразования и биологические активности из служащих примером, которые представляют собой типичные из имеющихся в промышленности ГАГ.

Испытания.

2.1. In vitrо определение антикоагуляционной активности (единицы USP: в соответствии с United States Pharmacopocia XIX, овечья плазма).

2.2. In vitro определение анти-Ха активности (в соответствии с Teien et al. Thrombosis Research Vol. 8.413, 1976), хромогенный способ с субстратом S-2222 (COATEST^R).

2.3. Оценка абсорбции с помощью определения анти-Ха активности гликозаминогликанов, например, гепарана, гепарина низкого молекулярного веса и гепаран сульфата. Используемый способ заключается в ex vivo оценке ингибирования фактора Ха после интрадуоденального введения крысе, кролику или собаке испытуемого соединения в сравнении с исходным гликозаминогликаном, провзаимодействовавшим с неорганическими ионами (натрий, кальций). Используемый способ определения представляет собой выше описанный хромогенный способ (COATEST^R); он позволяет определить спектрофотометрические величины, которые переводят с концентрации гликозаминогликанов в крови (мкг/мл), получаемые путем сравнения с калибровочной кривой, рассчитываемой для того же гликозаминогликана в форме натриевой соли, добавляемого к плазме in vitro. Указанную калибровочную кривую получают для каждого вида используемых гликозаминогликанов.

2.4. Оценка in vivo анти-тромботической активности гликозаминогликанов, не обладающих анти-Ха активностью, например, дерматан сульфата, после интрадуоденального введения в крысу (модель тромбоза Reyers et al. Thronb. Res. Vol. 8,669,1980, заключающаяся в перевязке ниже расположенной полой вены для того, чтобы вызвать стаз, а затем тромбоз). Используемый параметр представляет собой процентное ингибирование образования тромба.

Пример 1. Получение бис-N,N-диалкиламино-алкилен карбонатов (Х: -O-CO-O-).

Колбу, содержащую 500 мл толуола взвешивали, затем охлаждали льдом; газообразный фосген медленно пробулькивали в колбу (в течение около 1 ч) до тех пор, пока не достигали веса, соответствующего 0,55 моль. N,N-диалкиламино-спирт, соответствующий желаемому конечному продукту (1 моль) добавляли при перемешивании при 0^oC, и раствор оставляли стоять в течение 2 ч; затем его встряхивали с прохладным разбавленным водным раствором 0,58 моль К₂CO₃, затем с водой, наконец, его сушили над Na₂SO₄. Растворитель выпаривали, получая остатки, состоящие из конечных продуктов в виде бледно желтых или бесцветных масел, при средних выходах 90 Продукты можно очистить от любых следов исходных реактивов с помощью хроматографии на колонке (силикагель 60, 70 230 меш, растворитель для элюирования: бензол/тетрагидрофуран 60:40). Химико-физические характеристики некоторых из этого ряда продуктов представлены в табл. 1 (в которых R₁, R₂, R₃ и R₄ группы одинаковые, тогда как в соединении 5 R₁ и R₅, соответственно R₃ и R₄ группы, образуют пиперидиновое кольцо с атомом азота, с которым они связаны).

Пример 2. Получение бис-N,N-диалкиламино-алкилен карбонатов (Х: -O-CO-O-).

К раствору соответственным образом выбранного аминоспирта (1 моль в 250 мл тетрагидрофурана) добавляли металлический натрий (0,05 моль) и оставляли медленно растворяться в нем при комнатной температуре (в течение нескольких часов). Смесь разбавляли еще 250 мл тетрагидрофурана и добавляли N,N-карбонилдиимидазол (0,55 моль) при охлаждении, при необходимости доводя реакционную смесь до комнатной температуры. После 1 ч перемешивания растворитель удаляли в вакууме, и остаток переводили в хлороформ до полного растворения. Хлороформенный раствор промывали тем же объемом воды и выпаривали досуха с получением маслянистых остатков, состоящих из конечного продукта, при около 95 выходе от теоретического. Конечный продукт может далее быть очищен с помощью хроматографии в соответствии с описанным в примере 1.

Пример 3. Получение бис-N,N-диалкиламино-алкилен эфиров (Х: -O-CO-; n и m>1.

N, N-диалкиламино-спирт, соответствующий желаемому конечному продукту (0,05 моль) и триэтиламин (0,55 моль) растворяли в 500 мл безводного хлористого метилена. Раствор охлаждали до 0 5^oC, причем указанную температуру поддерживали в течение всего времени реакции. 0,55 моль акрилоил хлорида, растворенного в 150 мл хлористого метилена, медленно добавляли в реакционную колбу при перемешивании. В конце добавления реакцию оставляли при перемешивании протекать до завершения в течение 1 ч. Смесь фильтровали и фильтрат промывали водой (2х150 мл), насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (2х150 мл), затем водой (2х150 мл); органическую фазу затем сушили, и растворитель удаляли в вакууме. Остаток состоял из акрилата N,N-диалкиламино спирта при выходе 90 Этот остаток загружали в 1 л соответствующего N,N-диалкиламина и оставляли при комнатной температуре и при перемешивании в течение 18 ч. Избыток вторичного амина удаляли с помощью перегонки в вакууме (соответственно при 30^oC и 16 мм Нg), и остаток загружали в 1 л ацетонитрила; растворитель удаляли в вакууме (при 30^oC). Процедуру повторяли несколько раз до полного отсутствия любых следов свободного амина. Остаток представлял собой чистый конечный продукт, находившийся в виде желтоватого масла (100 выход). Химико-физические характеристики некоторых производных из указанного ряда представлены в табл. 1.

Пример 4. Получение бис-N,N-диалкиламино-метилен эфиров (Х -О-СО-; n 1; m 1).

N,N-диалкиламин, соответствующий желаемому конечному продукту (0,5 моль) и карбонат калия (0,05 моль) суспендировали в 1 л дистиллированной воды при комнатной температуре. Соответствующий альдегид (5 моль) добавляли при сильном перемешивании к суспензии, которая взаимодействовала с альдегидом в течение 24 ч. После этого сырой продукт экстрагировали хлороформом, промывая затем хлороформенный раствор соответствующим количеством воды (раствор А).

В то же самое время диалкил-глицин, соответствующий желаемому конечному продукту (0,5 моль), растворяли в 500 мл хлороформа и к раствору добавляли пиридин (0,5 моль) и дициклогексилкарбодиимид (0,5 моль); смесь держали при перемешивании при комнатной температуре в течение 1 ч (раствор В).

Раствор А добавляли к раствору В, и смесь держали при перемешивании при комнатной температуре в течение ночи. Затем ее фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме. Конечные продукты можно очистить от любых следов исходных реагентов с помощью хроматографии на колонке в соответствии с описанным в примере 1. Средний выход: 70
Пример 5. N,N-диалкиламино-алкилен амиды (Х:-NH-CO-; m 1).

N, N-диалкиламино-амин, соответствующий желаемому конечному продукту, (0,5 моль) и триэтиламин (0,55 моль) растворяли в 500 мл безводного хлористого метилена. Раствор охлаждали до 0 5^oC и медленно при перемешивании добавляли раствор акрилоил хлорида (0,55 моль) в 150 мл хлористого метилена, поддерживая температуру при около 0^oC. После этого смесь держали при перемешивании в течение 1 ч, затем фильтровали, и отфильтрованный раствор промывали водой, насыщенным раствором гидрокарбоната, затем снова водой; затем осуществляли методику, описанную в примере 3.

Остаток N,N-диалкиламино-алкилен-акриламид получали при 95 выходе. Превращение в желаемые N,N-диалкиламино-алкилен-амиды (при количественных выходах) происходит в соответствии с описанным в примере 3.

В табл. 1 представлены свойства некоторых производных указанного ряда.

Пример 6. Получение бис-N,N-диалкиламино-алкилен-мочевин (Х: -HN-CO-NH-).

Следовали методике примера 1, исходя из соответствующих N,N-диалкиламино-аминов. Выходы 95 100 от теоретического. Химико-физические характеристики некоторых производных из того ряда представлены в табл. 1.

Пример 7. Получение бис-N,N-диалкилмино-алкиленмочевин (Х: -HN-CO-NH).

Следовали методике примера 2, используя N,N-диалкиламино-амины вместо соответствующих амино-спиртов. Выход 95 100 от теоретического.

Пример 8. Образование соли гепарина (Р1) и бис-N,N-дибутил-этилен карбоната (табл. 1: основание 2; табл. 2: соль 2а) непосредственным солеобразованием гликозаминогликановой кислоты.

Водный раствор, содержащий 7,0 г гепарина, описанного в пункте 1.1 (продукт Р1), пропускали через колонку, содержащую 50 мл катионовой смолы Dowex 50Wx8, термостатируемую при 4^oC, собирая элюат вместе с промывками в сосуд, термостатируемый при 4^oC. Охлаждаемый раствор быстро нейтрализовали 6,23 г бис-N,N-дибутил-этилен карбоната (2). Затем раствор сушили замораживанием, и получали соль гепарина 2а в виде белого порошка.

В соответствии с той же методикой получали соли всех оснований и гликозаминогликанов, описанных в предваpительных замечаниях (продукты: Р1, Р2, Р3, Р4 и Р5).

В табл. 2 представлены химико-физические характеристики 2а наряду с характеристиками других солей гликозаминогликанов Р1, Р2, Р3, Р4, Р5 и других оснований, получаемых тем же способом.

Пример 9. Образование соли гепарина низкого молекулярного веса (Р2) и бис-N, N-дигексил-этилен-карбоната (табл. 1: основание 4, соль 4в) непосредственным солеобразованием гликозаминогликановой кислоты.

Водный раствор, содержащий 7,0 г гепарина, в соответствии с описанным в примере 8, пропускали через колонку, содержащую 50 мл катионной смолы Dowex 5Wx8, термостатируемую при 4^oС, собирая элюат вместе с промывками в сосуд, содержащий 9,05 г бис-N,N-дигексил-этилен-карбоната, термостатируемый при 4^oC.

Суспензию в начальной стадии при рН 5 перемешивали до полной нейтрализации (60 мин). Затем суспензию сушили замораживанием, и получали соль гепарина 4b.

В соответствии с той же методикой получали соли всех оснований и гликозаминогликанов Р1, Р2, Р3, Р4 и Р5.

В табл. 2 представлены химико-физические характеристики 2b наряду с характеристиками других солей гликозаминогликанов Р1, Р2, Р3, Р4, Р5 и других оснований, получаемых тем же образом.

Пример 10. Образование соли гепарина (Р1) и бис-N,N-дибутил-этилен-карбоната (табл. 1: основание 2; табл. 2: соль 2а) путем сдвига равновесия солеобразования мембранами.

7 г гепарина (продукт Р1, пункт 1.1) растворяли в 50 мл дистиллированной воды, и вдобавок к нему добавляли 7 г бис-N,N-дибутил-этилен-карбоната (2), в непрерывной системе диафильтрации, снабженной мембраной из ацетата целлюлозы (или полиэфирной, тефлоновой, полиамидной или полиуретановой мембраной) с сечением 200 1000 Д (предпочтительно 600 Д): при достижении 200 мл продукта диафильтрации добавляли еще 7 г бис-N,N-дибутил-этилен-карбоната и диафильтрации до отсутствия натрия в диафильтрате. Соль (2а, табл. 2), получаемая с помощью сушки вымораживанием, проявляла те же характеристики, что и соль, описанная в примере 7.

В соответствии с той же методикой получали соли оснований с гликозаминогликанами Р1, Р2, Р3, Р4 и Р5, некоторые примеры которых представлены в табл. 2.

Пример 11.

В табл. 3 представлены результаты ингибирования Ха фактора в соответствии с описанным в пункте 2.3, представленные в виде индексов абсорбции (в табл. 3 соли обозначены теми же аббревиатурами, которые указаны в табл. 1).

Количества назначаемых солей в водных растворах (за исключением 4b и 4а, назначаемых в суспензии полиэтиленгликолей, ПЭГ), выражены в виде мг/кг веса тела и соответствуют около 50 мг/кг солеобразованного гликозаминогликана (стандартный гепарин; гепарин низкого молекулярного веса; гепарин сульфат; сверхсульфатированный гепарин низкого молекулярного веса).

Уровни плазмы определяют на 30' от введения соединения и выражают в виде средней величины E.S. (животные: S.D Charles River крысы, весящие около 300 г, выдержанные без пищи, 5 животных на группу, под анестезией; или N.Z. кролики, доставленные от Bettinardi, около 2 кг весом, выдержанные без пищи, под анестезией, 3 животных на группу).

Как становится очевидным из табл. 3, абсорбции в 1,4 450 раз выше, чем абсорбции соответствующих гликозаминогликанов (считают, что для производного Р4 абсорбция равна 0, поскольку при используемых экспериментальных условиях его нельзя было дозировать статистически определенным образом).

Указанные абсорбции могут быть улучшены при использовании соответствующих носителей, вместо водного раствора, как показывают данные табл. 3, где продукты назначают в масляной суспензии (миглиол^R: 1 мл/кг) при тех же самых дозах.

Пример 12.

Производные, описанные в табл. 4, назначают в дозах, указанных в табл. 4, в тех же экспериментальных условиях, что и вышеуказанные. Через 30' после введения соединения определяют величины плазмы, в соответствии с описанным выше в пункте 2.3.

Пример 13.

Производные в табл. 5 назначают i. d. как описано в пункте 2.3, в представленных дозах, и уровни плазмы определяют в различное время через ингибирование активности Ха фактором. Результаты представлены в табл. 5.

Пример 14.

Производное 2а ввели i.d. собаке через дуоденальную фистулу в дозе 100 мг/кг. Были использованы гончие собаки, поступающие от Allevamento Alserio, весящие 10 12 кг (3 животных/группу). В табл. 6 представлены уровни гепарина в плазме, измеренные в соответствии с описанным в пункте 2.4, в разное время после i.d. обработки.

Пример 15.

Органические соли, получаемые из продуктов Р3 и Р5 (пункты 1.3 и 1.5) испытали в соответствии с моделью, описанной в пункте 2.4 через ингибирование активности образования тромба посредством стаза. В табл. 5 представлены процентные ингибирования для отдельных солей (обозначенных в соответствии с табл. 2), введенных посредством интрадуоденального пути за 30' до перевязки полой вены в дозах, представленных ниже, соответствующих 50 мг/кг продукта Р3.

Оценку тромба осуществляли после двухчасового стаза.

Использовали 10 крыс на группу (S.D, вес тела около 250 г), выдержанных без пищи и под анестезией. Результаты представлены в табл. 6.

Изобретение относится также ко всем аспектам промышленного применения, связанным с использованием солей гликозаминогликанов с катионами формулы I в качестве терапевтических средств. Поэтому осуществленный предмет изобретения обеспечивается фармацевтическими композициями, содержащими в качестве активного компонента терапевтически эффективные количества указанных солей наряду со стандартными наполнителями и носителями.

Примерами указанных фармацевтических композиций являются таблетки, пилюли в сахарной оболочке, сиропы, ампулы для перорального, внутримускульного, или внутривенного назначений и свечи, содержащие 5-500 мг активного компонента для назначения 1 3 раз в день.

Соли гликозаминогликана, способы их получения и фармацевтические композиции, содержащие указанные вещества.

Формула изобретения

1. Соли гликозаминогликанов с катионом общей формулы

где R₁ R₄ C₁ C₁₈-алкил, линейный или разветвленный, или R₁ и R₂, а также R₃ и R₄ вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют пиперидил;
R₅ и R₆ водород или C₁ C₄-алкил,
R₇ и R₈ водород;
n m целое число от 1 до 4;
X O-C(O)-O-.

2. Соли по п. 1, отличающиеся тем, что глюкозаминогликан выбирают из группы, состоящей из гепарина натрия свиного, натриевой соли низкомолекулярного гепарина, дерматана сульфата натрия, гепарана сульфата натрия, сверхсульфатированного фрагмента гепарина.

3. Гликозаминогликаны формулы

где R₁ R₄ C₁ C₁₈ алкил, линейный или разветвленный, или R₁ и R₂, а также R₃ и R₄ вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют пиперидил;
R₅ и R₆ водород или C₁ C₄ алкил;
n m целое число от 1 до 4;
X O-C(O)-O-, при условии, что когда R₁ R₄ метил, n и m не могут одновременно равняться 2.

4. Основание по п.3, отличающееся тем, что n m 2, R₁=R₂=R₃=R₄ бутил, этил или гексил, R₁ и R₃, а также R₃ и R₄ пиперидил; n m 3 или n m 4, R₁=R₂= R₃=R₄ этил, бутил или гексил.

5. Основание по п.3, отличающееся тем, что R₅ и R₆ водород, n m 2, 3 или 4, R₁=R₂=R₃=R₄ п-бутил или н-гексил,
а также их соли с гликозаминогликаном, выбранным из фракционированного гепарина или фракций гепарина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8