Способ получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов

 

Использование: микробиология, способы получения основы питательных сред. Сущность изобретения: способ получения питательной основы включает ферментативное расщепление мясокостного фарша пушных зверей (норка, песец, лисица) при соотношении фарш/вода, равном 1:2, поджелудочной железой крупного рогатого скота в концентрации 15-25% от объема субстрата в течение 16-32 ч. при pH 7,60,4 и температуре 402^oС. Питательная основа служит источником питательных веществ для широкого спектра микроорганизмов. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения основы питательных сред, и может быть использовано при получении основных питательных сред для биотехнологии.

Известен способ получения основы питательных сред путем ферментативного расщепления животного сырья (говяжьей вырезки) с последующей очисткой целевого продукта (Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии, М. 1950, с. 290-292). Говяжье или конское мясо очищают от жира и сухожилий, нарезают кусочками или полосками, кладут в кипящую воду из расчета 1 кг мяса на 2 л воды, кипятят в течение 5 мин. Мясо отделяют от жидкости и пропускают через мясорубку. Смешивают фарш и жидкость и дают остыть до 45^оС, после чего смесь помещают в бутыль с плотной резиновой пробкой, куда добавляют 5-10 г панкреатина или 40-80 г поджелудочной железы. Смесь доводят до pH 7,7-8,0, нагревают до 37^оС и гидролизуют в течение 7-10 сут. Перевар фильтруют, добавляют 10 мл хлороформа на 1 л смеси.

Однако для приготовления основы питательной среды используется нестандартное дорогостоящее пищевое сырье и процесс гидролиза длится 7-10 сут, что увеличивает себестоимость продукта.

Известен способ получения белковой основы микробиологических питательных сред, основанный на ферментативном расщеплении внутренних органов домашних птиц при pH 8,6-9,0 (авт.св. СССР N 878789, кл. С 12 N 1/20). После 7-8 сут выстаивания при 37^оС надосадочную жидкость декантируют, кипятят, добавляют раствор сернокислого аммония, суспензию кальция гидроокиси до появления в смеси избытка ионов кальция и фильтруют. После фильтрации смесь подогревают до 80^оС и избыток ионов кальция нейтрализуют раствором двузамещенного фосфата натрия, фильтруют и устанавливают pH 6,8-7,2.

Однако процесс приготовления питательной основы довольно трудоемкий и длится 7-8 сут, что увеличивает ее себестоимость.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов из органов или мышечных тканей ластоногих, преимущественно тюленей, имеющих утробный и вторичный волосяной покров (авт. св. СССР N 14026, кл. С 12 N 1/20). Гидролиз проводят при pH 8,0 в течение 24 ч при 50^оС. В качестве гидролизующего агента используют фарш поджелудочной железы, кишечника или желудка белька.

Однако в качестве белкового сырья используют органы или мышечные ткани ластоногих, промышленный забой которых в настоящее время значительно сокращен.

Задачей изобретения является расширение сырьевой базы и снижение себестоимости основ питательных сред для культивирования микроорганизмов.

Задача решеается тем, что в способе получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов, включающем ферментативное расщепление белкового сырья, в качестве исходного сырья используют мясокостный фарш пушных зверей при соотношении фарш/вода, равном 1:2, а гидролиз проводят поджелудочной железой в концентрации 15-25% от объема субстрата в течение 16-32 ч, pH 7,6 0,4, при температуре 42 2^оС.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

В реактор вместимостью 0,16 м³ заливают 90-100 л питьевой воды, нагревают до кипения и кипятят 5-10 мин. Затем загружают 50 кг мясокостного фарша пушных зверей (норка, лисица, песец).

Смесь нагревают до кипения и кипятят 15-20 мин. С поверхности смеси удаляют жир. Холодной водой через рубашку реактора при перемешивании устанавливают температуру 40 2^оС и 40%-ным раствором NaOH устанавливают pH 7,6 0,4. Загружают 7,5-12,5 кг фарша поджелудочной железы. Смесь выдерживают 10-15 мин и с поверхности смеси удаляют жир. Через час после введения фермента в гидролизуемой смеси определяют pH и корректируют ее в диапазоне 7,6 0,4. Гидролиз проводят в течение 16-32 ч при 40 2^оС с периодическим перемешиванием через 3-4 ч.

По окончании гидролиза смесь нагревают до кипения, после чего ее охлаждают холодной водой через рубашку реактора до 35-40^оС. Полученный гидролизат фильтруют через картон марки "Т" на фильтр-прессе.

Физико-химические показатели питательной основы приведены ниже: Общий азот, мг% 922 72 Аминный азот, мг% 577 90 Глубина расщепления белка, 60,1 7,6 Содержание хлоридов натрия, 0,19 0,06 Редуцирующие вещества, мг/л 0,32 0,09 Водородный показатель, ед. pH 74 0,2 Аминокислотный состав питательной основы, мг/л: Аспарагиновая кислота 3216 329 Треонин 3179 394 Серин 1964 301 Глутаминовая кислота 5684 709 Пролин 729 156 Глицин 2094 364 Аланин 4571 392 Валин 3418 265 Метионин 1727 92 Изолейцин 2336 189 Лейцин 5734 415 Тирозин 2134 299 Фенилаланин 3090 178 Гистидин 2612 183 Лизин 4071 327 Аргинин 2553 406 Итого 49787 5950 Изобретение позволяет значительно расширить сырьевую базу для приготовления питательных основ, так как в России существует около 120 зверохозяйств, в каждом из которых ежегодно получают от 15 до 150 т мяса или мясокостного фарша пушных зверей в качестве побочного продукта. Стоимость питательной основы, полученной по предлагаемому способу, в 10-12 раз ниже по сравнению с известной основой по Хоттингеру и в 2-3 раза по сравнению с питательной основой из органов или мышечных тканей ластоногих.

Мясной или мясокостный фарш пушных зверей является стандартным белковым субстратом. Стандартность его обусловлена тем, что животных кормят по научно обоснованному рациону; для забоя используют животных одного возраста в одно и то же время (осень, весна). Питательная основа, приготовленная из этого белкового сырья, обладает выраженным ростстимулирующим эффектом, поскольку содержит продукты гидролиза крови (тушки после забоя не обескровливают), а также большое количество витаминов группы А и В, неорганические соединения фосфора, калия, магния, железа, которые животное получает при кормлении.

Быстрое расщепление белка обусловлено также наличием в мясокостном фарше собственных ферментов печени, поджелудочной железы, селезенки и других внутренних органов животного.

Использование мясокостного фарша способствует повышению питательной ценности целевого продукта, так как кости являются источником необходимых для роста микроорганизмов ионов кальция, фосфора калия, а также продуктов гидролиза коллагена.

П р и м е р 1. В реактор вместимостью 0,16 м³ заливают 100 л питьевой воды, нагревают до кипения и кипятят 5-10 мин. Затем загружают 50 кг мясокостного фарша лисицы. Смесь нагревают до кипения и кипятят 15-20 мин. С поверхности смеси удаляют жир. Холодной водой через рубашку реактора при перемешивании устанавливают температуру 40^оС и 40%-ным раствором NaOH устанавливают pH 7,5. Загружают 7,5 кг поджелудочной железы, смесь выдерживают 10-15 мин и удаляют жир. Через час после введения фермента в гидролизуемой смеси определяют pH и при необходимости корректируют ее до 7,6 0,4. Гидролиз проводят в течение 16 ч при периодическом перемешивании через 3-4 ч.

По окончании гидролиза смесь нагревают до кипения, после чего ее охлаждают до 35-40^оС. Полученный гидролизат фильтруют через картон марки "Т" на фильтр-прессе. Питательная основа характеризуется следующими физико-химическими показателями: Общий азот, мг% 926 Аминный азот, мг% 537 Глубина расщепления белка, 58,0 Содержание хлорида натрия, 0,20 Редуцирующие вещества, мг/л 0,31 Водородный показатель, ед. pH 7,4 Общее количество аминокислот, мг/л 44536 П р и м е р 2. Исходные данные: мясокостный фарш лисицы 50 кг; поджелудочная железа 12,5 кг; pH реакционной смеси 7,6; продолжительность гидролиза 16 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 880 Аминный азот, мг% 565 Глубина расщепления белка, 64,7 Содержание хлорида натрия, 0,19 Редуцирующие вещества, мг/л 0,25 Водородный показатель, ед. pH 7,5 Общее количество аминокислот, мг/л 46926 П р и м е р 3. Исходные данные: мясокостный фарш лисицы 50 кг; поджелудочная железа 7,5 кг; pH реакционной смеси 7,2; продолжительность гидролиза 32 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 982 Аминный азот, мг% 640 Глубина расщепления белка, 65,2 Содержание хлорида натрия, 0,20 Редуцирующие вещества, мг/л 0,34 Водородный показатель, ед. pH 7,2 Общее количество аминокислот, мг/л 52951 П р и м е р 4. Исходные данные: мясокостный фарш 50 кг; поджелудочная железа 7,5 кг; pH реакционной смеси 7,5; продолжительность гидролиза 16 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 920 Аминный азот, мг% 552 Глубина расщепления белка, 60,0 Содержание хлорида натрия, 0,21 Редуцирующие вещества, мг/л 0,32 Водородный показатель, ед. pH 7,4 Общее содержание аминокислот, мг/л 45343 П р и м е р 5. Исходные данные: мясокостный фарш песца 50 кг; поджелудочная железа 12,5 кг; pH реакционной смеси 7,8; продолжительность гидролиза 32 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 960 Аминный азот, мг% 593 Глубина расщепления белка, 61,8 Содержание хлрида натрия, 0,23 Редуцирующие вещества, мг/л 0,32 Водородный показатель, ед. pH 7,6 Общее содержание аминокислот, мг/л 51840 П р и м е р 6. Исходные данные: мясокостный фарш норки 50 кг; поджелудочная железа 7,5 кг; pH реакционной смеси 7,5; продолжительность гидролиза 16 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 890 Аминный азот, мг 521 Глубина расщепления белка, 58,5 Содержание хлорида натрия, 0,20 Редуцирующие вещества, мг/л 0,30 Водородный показатель, ед. pH 7,4 Общее содержание аминокислот, мг/л 46541.

П р и м е р 7. Исходные данные: мясокостный фарш норки 50 кг; поджелудчная железа 7,5 кг; pH реакционной смеси 7,4; продолжительность гидролиза 32 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 921 Аминный азот, мг% 544 Глубина расщепления белка, 59,1 Содержание хлорида натрия, 0,20 Редуцирующие вещества, мг/л 0,29 Водородный показатель, ед. pH 7,2 Общее содержание аминокислот, мг/л 48233.

Использование питательной основы для приготовления питательных сред, применяемых для выращивания микроорганизмов бактериальной природы, иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 8. Берут питательную основу, приготовленную по примерам 1-7, разбавляют дистиллированной водой до концентрации 120 мг% по аминному азоту. К 1 л смеси добавляют 3,0 г хлористого натрия и 1,0 г Na₂HPO₄, кипятят 20 мин, устанавливают pH 7,2, разливают в стерильные флаконы по 100,0 мл, стерилизуют автоклавированием при 110^оС 30 мин. В питательную среду во флаконах вносят 24-часовую суспензию вакцинного штамма ЕВ чумного микроба в концентрации 1,010⁹ м.кл (1 мл 110⁷ м.кл), выращивают в течение 48 ч при 28^оС.

После инкубирования количество биомассы чумного мкроба достигает 1,710⁹ мкл/мл, на среде из прототипа 0,910⁹ мкл/мл, на среде из перевара мяса по Хоттингеру 0,610⁹ м.кл/мл.

П р и м е р 9. Берут питательную основу по примерам 1-7, разводят физиологическим раствором хлористого натрия в соотношении 1:6, разливают по 50 мл во флаконы, стерилизуют при 110^оС в течение 20 мин. В охлажденный до 38^оС бульон вводят посевной материал из расчета 0,2 млрд.кл/мл, выращивают при 38^оС в течение 24 ч. Полученные результаты приведены в таблице.

Из данных таблицы следует, что питательные основы, приготовленные по предлагаемому способу, обладают хорошими ростовыми свойствами и могут быть использованы при культивировании различных микроорганизмов бактериальной природы.

Формула изобретения

Способ получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов, включающий ферментативный гидролиз белкового сырья, отличающийся тем, что в качестве белкового сырья используют мясокостный фарш пушных зверей при соотношении фарша и воды 1 2, гидролиз проводят поджелудочной железой крупного рогатого скота в конечной концентрации 15 25% от объема субстрата в течение 16 32 ч при рН 7,6 0,4 и (40 2)^oС.

РИСУНКИ

Рисунок 1