Способ получения иммобилизованного иммуноглобулина на твердой фазе

 

Использование: в медицине и микробиологии. Сущность: проводят обработку твердой фазы комплексом "иммуноглобулин - фибриноген", полученным обработкой 1 %-ным глутаровым альдегидом в течение 3 - 4 ч в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, pH 7,4 или 0,05 М карбонатно-бикорбонатном буфере, pH 9,5, при соотношении иммуноглобулин: фибриноген 1:1 и 1:2. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, более конкретно к микробиологии, и может быть использовано в лабораторной диагностике.

Известно, что критическим фактором, определяющим успешное применение твердофазного иммуноферментного анализа в целях поиска антигенов, является адсорбция антител на твердофазном носителе.

На практике твердофазного ИФА вошел метод физической адсорбции антител на поверхности микроплат из полистирола. Связь белков с матрицей в данном случае осуществляется в основном за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий, эта связь лабильна. Однако легкость разделения компонентов по окончании реакции, достигаемая простой промывкой плат, обеспечивает этому методу широкое применение. Количество адсорбированного вещества зависит от многих факторов (температуры, рН, ионной силы, времени инкубации и т. д.) и изменяется при их варьировании.

Для улучшения адсорбирующей способности пластин (планшетов) исследователи используют различные способы это предварительная обработка ультрафиолетовым светом, этилхлорформатом, диоксидом силиция, глютаровым альдегидом, полилизином, полиэтиленгликолем и другие.

Наиболее близким способом (прототипом) является способ обработки лунок полистироловых планшетов при постановке ТИФА на этапе сенсибилизации смесью иммуноглобулина с 4-9% -ным раствором полиэтиленгликоля (Oskan A.N. Пат. 4450231, USA, 1982, кл. 01 G 33/54, 435/7).

Однако эта методика окончательно не решила проблему оптимизации адсорбции иммуноглобулинов на твердую фазу и, особенно, при использовании дефектных планшетов.

Техническим результатом данного изобретения является повышение степени связывания иммуноглобулинов с полистиролом и тем самым стандартизация результатов ТИФА.

Технический результат достигается за счет использования на первом этапе постановки ТИФА фаза сенсибилизации (адсорбции) комплекса[иммуноглобулин-фибриноген] в соотношении 1:1-1:2.

Фракцию иммуноглобулинов класса G изолировали с использованием полиэтиленгликоля.

В качестве фибриногена для метки чумных, сапных, бруцеллезных и сибиреязвенных иммуноглобулинов использовали лиофилизированный препарат Волгоградской областной станции переливания крови МЗ РФ.

Конструирование препарата "иммуноглобулин-фибриноген" осуществляли по принципу одноэтапного глютаральдегидного метода.

Для этого брали 10 мг иммуноглобулина, растворяли его в 1,0 мл 0,1 М фосфатно-буферного раствора (ФБР), рН 6,8 и 7,4 или в 1,0 мл карбонатно-бикарбонатного буфера (КББ), рН 9,5 и добавляли 10, 20 мг фибриногена. При осторожном перемешивании на магнитной мешалке вносили 0,1 мл свежеприготовленного 1%-ного раствора глютарового альдегида. Смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 3 ч. Затем проводили диализ против соответствующего буферного раствора 18-24 ч на холоде. Полученные конъюгаты проверяли на серологическую и сенсибилизирующую активность на испытанных пригодных для ТИФА полистироловых планшетах. Результаты конструирования препаратов "иммуноглобулин-фибриноген" отражены в табл. 1.

Результаты, приведенные в табл. 1 (примере 1) получены путем постановки ТИФА: сенсибилизацию планшетов проводили комплексом иммуноглобулин-фибриноген, путем внесения 0,1 мл препарата и выдержкой плат в холодильнике +4^оС в течение 18-24 ч. Затем лунки планшета промывали двукратно 0,15 M NaCl, рН 6,8 с 0,05% твин-20. Перед использованием открытые участки лунок блокировали путем внесения 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина на 0,05 М КББ, рН 9,5 и планшеты оставляли на 30 мин при 37^оС. После этого лунки промывали трехкратно по 3 мин 0,15 М NaCl с твин-20 и подсушивали; постановка реакции. Из исследуемого материала, содержащего антиген, готовили ряд последовательных разведений в 0,1 М ФБР, рН 7,4 с твин-20 и вносили по 0,1 мл в лунки планшета, инкубировали в термостате при +37^оС 1 ч. Затем содержимое лунок выливали, отмывали 0,15 М NaCl с твин-20 трехкратно по 3 мин. На следующем этапе в лунки планшета вносили рабочее разведение конъюгата, приготовленного на 0,1 М ФБР, рН 7,4 с твин-20 и инкубировали планшеты в течение 1 ч в термостате при +37^оС. После заключительной отмывки 4-5 кратно по 3 мин в каждую лунку планшета вносили рабочий раствор субстрата. Результаты реакции учитывали визуально по изменению цвета содержимого лунок или на спектрофотометре после внесения рабочего раствора о-фенилендиамина.

Наряду с опытными реакциями ставили следующие контроли: реакция с заведомо известным антигеном. Этот контроль проводится для проверки правильности выбора рабочего разведения конъюгата и чувствительности препарата. Положительный контроль; реакция в лунках, сенсибилизированных одним фибриногеном. Отрицательный контроль; контроль субстрата. В сенсибилизированную лунку вносили только субстрат. Контроль отрицательный.

Чувствительность теста выражается в микробных клетках на 1 мл 1 10³-10⁹.

Вывод: конструирование препарата "иммуноглобулин-фибриноген" можно проводить в 0,1 М ФБР, рН 7,4 и 0,05 М КББ, рН 9,5 при соотношении 1:1 и 1: 2.

П р и м е р 1. Использование препарата "иммуноглобулин-фибриноген" для обнаружения возбудителей опасных инфекций. Результаты показаны в табл. 2.

Вывод: препарат Иг:Ф обеспечивает постановку ТИФА на любых полистироловых планшетах без предварительного контроля и при этом реакция воспроизводится стабильно.

П р и м е р 2. Специфичность способа определяли исследованием близкородственных и гетерологичных штаммов (всего 53 штамма) микроорганизмов. При сравнительном изучении классического способа постановки ТИФА и предложенного способа получены аналогичные отрицательные результаты.

Вывод: использование Иг:Ф не снижает специфичность ТИФА.

П р и м е р 3. Воспроизводимость теста определяли путем постановки ТИФА с 10 гомологичными штаммами каждого вида возбудителя она была 100% но чувствительность теста зависела от штамма микроорганизма.

Вывод: воспроизводимость предложенного метода 100% П р и м е р 4. Для исследования поступило сто проб полевого материала, подозреваемого на зараженность возбудителем чумы. Анализ проводили с помощью коммерческой иммуноферментной системы. На первом этапе сенсибилизацию проводили двух видов планшет (пригодных и непригодных для постановки ТИФА) прилагаемым к коммерческой тест-системе иммуноглобулином и предлагаемым комплексом Иг-Ф. Результаты отражены в табл. 3.

Вывод: благодаря предлагаемому способу удалось получить положительные результаты и на непригодных для постановки ТИФА по адсорбционной способности планшетах.

Использование предлагаемого способа по сравнению с известным имеет ряд преимуществ: создает возможность использования полистироловых планшетов любых марок без предварительного контроля на адсорбирующую способность; повышается воспроизводимость реакции и в конечном счете стандартизация результатов ТИФА.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА НА ТВЕРДОЙ ФАЗЕ, включающий обработку твердой фазы сенситином, отличающийся тем, что в качестве сенситина используют комплекс иммуноглобулина с фибриногеном, полученный обработкой 1%-ным глютаровым альдегидом в течение 3-4 ч в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, рН 7,4 или 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5 при соотношении иммуноглобулин: фибриноген - 1:1-1:2 соответственно.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2