Способ получения гибридного белка -фактор некроза опухолей - тимозина a1

 

Использование: биотехнология. Изобретение позволяет повысить выход гибридного белка путем культивирования свежеполученных трансформантов, отобранных на начальной фазе экспоненциального роста и хранившихся при - (20 - 40^oС) в бульоне с 40% глицерином. Осадок, получившийся после лизиса клеток, отмывают 1 - 3 М растворами мочевины и растворяют в 7 М мочевине, раствор наносят на аниообменный сорбент при pH 5,6 - 5,8, элюцию ведут тем же буфером с добавлением 150 мМ NaCl, затем фракции с гибридным белком наносят на матрицу с иммобилизованным красителем (голубой), уравновешенную буфером с 7 М мочевиной при pH 5,5 - 5,8 и элюируют белок буфером с градиентом pH 7,0 - 8,5 в присутствии 7 М мочевины и 10 М NaCl, с последующим диализом против раствора, содержащего 150 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфата, при pH 7,2 - 7,4. 1 з. п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гибридного белка -фактор некроза опухолей-тимозин- ₁ (ФНО-Т).

Известен способ культивирования штамма E.coli SG20050 [1] с плазмидой pThy314 [2] ШТамм трансформируют плазмидой и высевают на чашку Петри с питательным агаром, содержащим ампициллин. Выросшие колонии используют для пересевов и последующего хранения (в том числе в Коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ Генетика) или для культивирования в питательном L-бульоне, сначала в пробирках или колбах, а затем в ферментере. Как отмечалось выше, указанный способ не позволяет получать высокий уровень синтеза гибридного белка из-за нестабильности штамма SG20050 с плазмидой pThy314 при хранении на плотных питательных средах.

Задача изобретения создание способа, обеспечивающего стабильное наследование плазмиды pThу315 в процессе культивирования и получение максимального синтеза гибридного белка ФНО-Т.

Поставленная задача решается культивированием свежеполученных трансформантов штамма SG20050 (pThy315) при 36-37^оС или трансформантов, отобранных на начальной фазе экспоненциального роста и хранившихся при минус 20-40^оС в бульоне с 40% глицерином, осадок, получившийся после лизиса клеток, отмывают 1-3 М растворами мочевины и растворяют в 7 М мочевине, полученный раствор наносят на анионообменный сорбент при рН 5,6-5,8 с элюцией тем же буфером с добавлением 150 мМ NaCl, после чего фракции с гибридным белком наносят на сорбент с иммобилизованным красителем (голубой), уравновешенный буфером с 7 М мочевины при рН 5,5-5,8 и элюируют белок буфером с градиентом рН 7,0-8,5 в присутствии 7 М мочевины и 1,0 М NaCl с последующим диализом при рН 7,2-7,4 против раствора, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ Na-фосфата. А также тем, что культивирование проводят в среде следующего состава: 1-1,4% пептона или триптона, 1-1,6% дрожжевого экстракта, 1-1,15% NaCl и 50 мкг/мл ампициллина.

Гибридный белок ФНО-Т, полученный этим способом, имеет молекулярную массу 211 кДа по подвижности в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН), чистоту более 95% по данным электрофореза в ПААГ-ДСН и обладает цитотоксичностью для клеток фибросаркомы мыши линии L-929 равной (1-2)10⁶ ЕД/мг. При расщеплении гибридного белка бромцианом в 70%-ной муравьиной и 0,1%-ной трифторуксусной кислотах при комнатной температуре в течение 20-30 ч образуются два фрагмента, соответствующие ФНО с молекулярной массой 17,50,5 кДа и тимозину ₁ с молекулярной массой 3,10,1 кДа. Гибридный белок ФНО-Т взаимодействует с антисыворотками против ФНО и тимозина ₁ в иммуноферментном анализе.

П р и м е р 1. Культивирование для получения гибридного белка ФНО-Т.

Выращивают штамм Е.соli SG20050 в 5 мл LB при 37^оС в течение ночи. Разводят культуру свежим LB в 50-100 раз и растят на качалке при 37^оС до оптической плотности при 590 нм равной 0,2-0,3. Если оптическая плотность более 0,3 культуру разводят свежим LB до 0,1 и подращивают 30 мин. Переносят 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждают клетки при 4^о С 5000 g в течение 10 мин. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 50 мл 0,1 М CaCl₂, охлажденного на льду. Инкубируют клетки 20 мин на льду. Осаждают клетки 10 мин при 5000 об/мин, 4^оС. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 3 мл 0,1 М CaCl₂, охлажденного на льду. К компетентным клеткам можно добавить стерильный глицерин до 15% и хранить клетки для трансформации до трех месяцев при минус 70^оС. Переносят 3 мл компетентных клеток в холодную пробирку и добавляют 5-10 мкг плазмидной ДНК pThy315. Инкубируют на льду 1 ч. Переносят пробирку на 42^оС 5 мин. Переносят клетки в колбу с 100 мл подогретого до 37^оС L-бульона без антибиотика и инкубируют при 37^оС 1-1,5 ч. Заполняют ферментер вместимостью 10 л L-бульоном объемом 7 л с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл. Прогревают ферментер до необходимой температуры и вносят посевную дозу 100 мл L-бульонной культуры свежеполученных трансформантов. Культивируют при необходимой температуре, 250-300 об/мин с продувкой воздуха 0,5 л/мин на л бульона. При достижении стационарной фазы роста бульон сливают, берут пробу для определения уровня синтеза гибридного белка методом электрофореза в 15% ПААГ-ДСН. Клетки отделяют центрифугированием или микрофильтрацией и используют для выделения гибридного белка. Экспериментально определено, что культивирование штамма SG20050 (pThy315) при 30-34^оС приводит к образованию 10-15% гибридного белка в растворимой форме; при температуре ниже 30^оС штамм не растет; при 36-37^оС практически весь белок находится в клетках в нерастворимой форме.

П р и м е р 2. Использование консервированных клеток трансформированного штамма Е.соli для культивирования и получения гибридного белка.

Трансформацию штамма Е.соli SG20050 плазмидой и культивирование свежеполученных трансформантов проводят как в примере 1, за исключением: а) в экспоненциальной фазе роста штамма производят отбор культуры, добавляют стерильный глицерин до 40% и хранят клетки при минус 20-40^оС в течение нескольких месяцев. Для последующих культивирований в 10 л ферментере используют в качестве посевного материала консервированные клетки трансформированного штамма. Клетки, выросшие до стационарной фазы роста, непригодны для последующих культивирований; б) для культивирования в большем объеме клетки в экспоненциальной фазе роста из 10 л ферментера используют как посевной материал для инокуляции в 100 или 250 л ферментер.

П р и м е р 3. Подбор состава питательного бульона для культивирования.

Состав использованных сред представлен в табл. 1. Культивирование проводят в колбах при 37^оС в течение 18 ч. Для засева в каждый питательный бульон используют свежеполученные трансформанты (пример 1) или консервированные клетки (пример 2). Результаты культивирований представлены в табл. 2.

Полученные данные однозначно показывают, что пептон, дрожжевой экстракт и хлористый натрий являются необходимыми и достаточными компонентами для получения биомассы клеток и синтезируемого ими гибридного белка.

Для оптимизации состав питательного бульона проведены культивирования с варьированием количества компонентов как указано в табл. 3 В качестве оптимального выбран состав бульона 6 (табл.3), обеспечивающий высокий уровень роста клеток и синтез гибридного белка и содержащий наименьшие количества компонентов. Указанный состав бульона обеспечивает также устойчивый рН в процессе культивирования, что позволяет исключить необходимость подтитровки бульона щелочью или кислотой.

П р и м е р 4. Выделение и очистка гибридного белка ФНО-Т.

Клетки штамма SG20050 с плазмидой рThy315, выращенные при 36-37^оС, осаждают центрифугированием при 6000 об/мин 4^оС в течение 10 мин. Бульон сливают, клетки суспендируют в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-НСl рН 7,5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторида, из расчета на 1 г клеток 10 мл буфера. Клетки разрушают каким-либо способом (например: замораживанием-оттаиванием, или импульсами ультразвука три раза по 40 с, или продавливанием в замороженном состоянии через фильеру в French-прессе или Х-прессе). Лизат центрифугируют 10 мин при 4^оС, 5000 g. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют раствор 1 М мочевины из расчета 10 мл на 1 г клеток, интенсивно перемешивают. Повторяют центрифугирование. Супернатант сливают, осадок суспендируют в растворе 2 М мочевины того же объема. Повторяют центрифугирование. Супернатант сливают, осадок растворяют в 7 М мочевине того же объема. Повторяют центрифугирование. Надосадочная жидкость представляет собой раствор гибридного белка ФНО-Т около 60-70%-ной электрофоретической чистоты. Полученный раствор белка в 7 М мочевине хроматографируют на носителях ДЭАЭ. Носитель промывают тремя объемами 50 мМ ацетатного буфера рН 5,8 сначала без мочевины, а затем тремя объемами 25 мМ ацетатного буфера рН 5,8 с 7 М мочевины. Раствор белка в 7 М мочевине титруют уксусной кислотой до рН 5,8 и наносят на колонку. Загрузка на 100 мл носителя около 50 мл гибридного белка. Промывают сразу после нанесения белка равным по объему колонки 25 мМ ацетатным буфером рН 5,8 с 7 М мочевиной; затем пятью объемами 150 мМ NaCl в 25 мМ ацетатном буфере рН 5,8 с 7 М мочевиной, собирая фракции. Аликвоты из фракции по 20 мкл анализируют электрофорезом в 15% ПА-АГ-ДСН. Фракции, содержащие гибридный белок, очищают хроматографией на голубой агарозе. Носитель голубой агарозе. Носитель голубой агарозы уравновешивают 50 мМ Na-ацетатным буфером рН 5,8, с 7 М мочевиной и 0,15 М NaCl. Фракции с ДЭАЭ объемом до 200 мл наносят на колонку с 30 мл носителя. Элюируют гибридный белок растворами с градиентом рН 7,5-8,7 30 мМ трис-НСl и градиентом концентрации 0,5-1M NaCl c 7 М мочевиной и 5 Мм ЭДТА. Получают белок на менее 95-ной электрофоретической чистоты. Фракции, содержащие гибридный белок, диализуют при 4-8^оС в течение 18 ч против 100 объемов 150 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфата рН 7,2-7,4. Заменяют буфер на свежий и диализуют еще несколько часов. Белок хранят при -20^оС.

П р и м е р 5. Проверка биологической активности гибридного белка в тесте цитотоксичности на линии клеток L-929.

Клетки фибросаркомы мыши L-929 выращивают на среде RPMI 1640 с добавлением до 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, 2 мМ L-глютамина и 50 мкг/мл гентамицина (ростовая среда). Клетки помещают в виде суспензии в ростовой среде в лунки планшета из расчета 410⁴ клеток на лунку в объеме 100 мкл. Инкубируют планшеты при 37^оС в атмосфере, содержащей 5% СО₂, в течение ночи до образования монослоя. После инкубации удаляют среду и добавляют по 100 мкл свежей ростовой среды с 1 мкг/мл актиномицина D и двухкратными разведениями исследуемых гибридных белков. В качестве контроля используют чистый ФНО. Клетки дополнительно инкубируют в течение ночи при тех же условиях. После инкубации среду удаляют и клетки окрашивают 0,5% раствором генцианового фиолетового в течение 15 мин, после чего промывают водой и измеряют оптическую плотность. За единицу активности принимают разведение препарата, вызывающее 50 гибель клеток, учитывая исходную концентрацию гибридного белка в препарате делают перерасчет единиц активности на мг белка. Гибридный белок ФНО-Т обладает цитотоксической активностью (1-2) 10⁶ ед/мг.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИНА a₁ путем культивирования штамма Escherichia Coli SG20050, трансформированного введением плазмиды, кодирующей синтез указанного белка, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка, отличающийся тем, что используют указанный штамм с введенной плазмидой pThy315, культивирование проводят при 36 - 38^oС, причем используют свежеполученные трансформанты или отобранные на начальной фазе экспоненциального роста и хранившиеся при - 20. ..-40^oС в бульоне с 40% глицерина, после лизиса клеток осадок отмывают 1 - 3 М растворами мочевины и растворяют в 7 М растворе мочевины, полученный раствор наносят на анионообменный сорбент при рН 5,6 - 5,8 с элюцией тем же буфером с добавлением 150 мМ NaCl, после чего фракции с гибридным белком наносят на сорбент с иммобилизованным красителем (голубой), уравновешенный буфером с 7 М мочевины при рН 5,5 - 5,8, и элюируют белок буфером с градиентом рН 7,0 - 8,5 в присутствии 7 М мочевины и 1 М NaCl с последующим диализом при рН 7,2 - 7,4 против раствора, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ Na-фосфата.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование проводят в среде, содержащей 1 - 1,4% пептона или триптона, 1 - 1,6 % дрожжевого экстракта, 1 - 1,15% NaCl и 50 мкг/мл ампицилина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2