Способ прогнозирования состояния водных биоценозов
Использование: водная экология (биологический мониторинг природных экосистем) и охрана окружающей среды, в частности, способы биологической индикации загрязнения водной среды. Сущность: с целью индикации ранних изменений в водном биоценозе проводят определение титра лизоцимактивных и антилизоцимактивных микроорганизмов с последующим определением индекса при этом, если индекс меньше 1 (ЛI), прогнозируется ухудшение в состоянии водного биоценоза, если больше или равен 1 (Л
I), стабилизация и изменение в сторону улучшения в состоянии биоценоза. 8 табл.
Изобретение относится к вопросам экологии и охране окружающей среды и может быть использовано для контроля антропогенного загрязнения водной среды, в частности для индикаций и прогнозирования состояния биоценозов.
Изобретение предназначено для использования в работе областных и республиканских санитарно-эпидемиологических станций, специализированных лабораторий и НИИ, занимающихся вопросами оценки степени экологического неблагополучия водной среды природных водоемов. В поверхностные воды рек, озер, водохранилищ, морей и океанов поступает большое количество разнообразных загрязнителей как химической, так и биологической природы. Мощный приток загрязнений изменяет среду обитания гидробионтов, в результате изменяется их качественный и количественный состав меняется биоценоз и изменяется качество воды. В связи с этим встает задача разработки принципов оценки качества вод в водоемах и оценки нормального или патологического состояния водоема. Наиболее остро возникает вопрос о возможности ранней индикации ближайших и отдаленных последствий воздействия антропогенных факторов на биоценоз в целом. Уровень антропогенного воздействия на окружающую среду определяют по разным показателям: химическим, бактериологическим и гидробиологическим, ПДК на отдельные токсиканты. Качество воды формируется всеми водными организмами, их качественным и количественным составом в водном биоценозе, т.е. качество воды является как бы результирующим между гидробионтами и поступающими в водоем веществами. В качестве тестов биоиндикации антропогенного воздействия на водоем большую роль играют бактерии, простейшие, водоросли, беспозвоночные и животные фильтраты. В биоиндикации антропогенного загрязнения водоема широкое распространение получили методы, основанные на учете общего числа сапрофитных бактерий, выращенных на МПА по методу Коха, заключающиеся в посеве глубинным способом 0,1 мл исследуемой воды в мясопептонный агар и инкубированием этих посевов в термостате при 20-25оС в течение 10 сут с последующим учетом выросших колоний. Недостатком метода является длительность в получении результатов, а отсюда низкая оперативность в реакции на загрязнение. Оценка состояния биоценоза по этому методу осуществляется по количественным параметрам и не дает представления о качественных изменениях в микроценозе. В другом весьма распространенном методе оценка качества воды осуществляется на основании коли-титра и коли-индекса. Кишечная палочка сапрофит, но ее обнаружение в воде свидетельствует о возможности присутствия в ней и патогенных энтеробактерий. Существуют два метода: метод мембранных фильтров и двухфазный бродильный метод. Недостатком обоих методов является их большая трудоемкость (фильтрация, посев, приготовление и окраска мазков), а также использование большого числа сред и красителей (ХЧ лактозы, глюкозы, желчи, основного фуксина, р-ра сульфата натрия, бромтимолового синего, розовой кислоты), что может приводить к удорожанию проводимых исследований. Метод позволяет учитывать лишь изменения в биоценозе, отражающие санитарное состояние воды, и не дает возможности прогнозирования разных экологических изменений в водоеме. Таким образом, предлагаемые бактериологические анализы характеризуют качество современных поверхностных вод не полно, а значит не дают истинного представления о состоянии биоценоза в данном типе водоема. Наиболее надежно характеризует качество воды и состояние водного биоценоза гидробиологические показатели, оценивающие пригодность воды для питьевого водоснабжения, а водоема для рыбохозяйственных целей. Одним из гидробиологических способов оценки класса качества воды и водоема является способ, предложенный В. Н.Жукинским. В его основу положена оценка состояния водоема по качественному и количественному составу фитопланктона, позволяющему оценить водоем по степени сапробности. В основу предлагаемого метода авторы положили не только количественные и качественные показатели гидробионтов, но и их физиологическую активность (продукцию фитопланктона, индекс самоочищения и т.д.). Однако, метод не лишен целого ряда недостатков: длительность и трудоемкость обработки взятых проб, а отсюда и низкая оперативность в регистрации антропогенного воздействия на состояние биоценоза; регистрация уже состоявшегося изменения в биоценозе, а не предсказание его начала; не учитываются механизмы, обеспечивающие функционирование сообщества. В связи с этим целью изобретения является биоиндикация ранних изменений в водном сообществе, повышение точности прогнозирования состояния биоценоза. Решение поставленной цели осуществляется путем использования в качестве тестов биоиндикации титра лизоцимактивных (ЛА) и антилизоцимактивных (АЛА) микроорганизмов с последующим определением отношения ЛА/АЛА. Достижение поставленной цели возможно лишь при точном и достаточно полном выделении лизоцимактивных и антилизоцимактивных форм микроорганизмов из природной среды водоема. Однако это составляет некоторую трудоемкость. Существующий способ посева исследуемой воды на безбактериальную воду с последующим подращиванием при 25-28оС несмотря на то, что безбактериальная воды содержит все необходимые минеральные и органические вещества, необходимые для жизнедеятельности свободноживущих микроорганизмов, не дает возможности преимущественного выделения микроорганизмов с антилизоцимной активностью, относящихся к потенциально-патогенным. Поэтому второй целью, определяющей признак предлагаемого изобретения, является разработка способа, позволяющего выделять бактерии с антилизоцимной активностью из воды природных водоемов, что обеспечит повышение точности для осуществления экологической оценки санитарного состояния водоема при определении отношения ЛА/АЛА микроорганизмов в исследуемой воде. Поставленная цель достигается тем, что исследуемая пробы воды из природного водоема (исследуемый материал) в количестве 1 мл засевается в жидкую среду накопления, приготовленную из натуральной воды с естественным содержанием органического вещества, которая дополнительно в целых выделения микроорганизмов с антилизоцимной активностью содержит лизоцим в концентрации 5-10 мкг/мл при следующем соотношении компонентов: водный раствор лизоцима в концентрации 5













биоценоза биоценоза
Новизна заявляемого способа заключается в том, что:
1. Для оценки и прогнозирования состояния водного биоценоза используется отношение лизоцим-антилизоцим водных микробов. Представляется логичным, что воздействие антропогенных факторов химической и биологической природы может изменять как лизоцимные, так и антилизоцимные параметры водных микробов и их числовые соотношения, а следовательно, сопоставление ЛА и АЛА микрофлоры может характеризовать состояние водного биоценоза. При этом в качестве индикационного параметра используется вычисление отношения качества ЛА/АЛА микроорганизмов. В научно-технической литературе имеются сведения об использовании отношения количества лизоцим тканей антилизоцимная активность микроорганизмов. Но указанная зависимость, во-первых, используется для оценки клинического течения заболевания и, в частности, для прогнозирования бактерионосительства, во-вторых, изучается взаимоотношение не в сообществе микроорганизмов, а в системе "макроорганизм-микроорганизм", в-третьих, изучаются патогенные микроорганизмы, вызывающие заболевание, а не свободно живущие микроорганизмы. Предлагаемое техническое решение применяется впервые в гидробиологии и, следовательно, обладает достаточной долей новизны. 2. Подращивание исследуемого материала в жидкой питательной среде в присутствии определенного количества лизоцима известно для патогенных микроорганизмов и используется в клинической микробиологии для установления диагноза заболевания. При этом осуществляется подращивание исследуемого материала (клеток слущенного эпителия из уретры, кишечника, носа, бронхов и т.д.) в средах 199 и Игла с последующим выделением чистой культуры возбудителя и его идентификацией. Однако приведенные методы или общий принцип, положенный в их основу, направлен на поиски возбудителя болезни. Использование в качестве исследуемого материала клеток эпителия оправдывает применение сред 199 и Игла, как наиболее близких по составу к внутренней среде тканей организма и обеспечивающих жизнеспособность как клеток, так и возбудителя, находящегося в них. В нашем случае отличием является то, что выделение возбудителя не осуществляется, используется другая по составу питательная среда (безбактериальная вода), а добавление в среду лизоцима обеспечивает повышение точности выделения всего множества антилизоцимактивных форм свободно живущих микроорганизмов. Способ существенно отличается от прототипа, так как в качестве инструмента биологической индикации состояния водного биоценоза предложено использовать более ранние признаки, определяемые в микрофлоре водоема соотношение количества лизоцимактивных форм к антилизоцимактивным. Положительный эффект способа реализуется через повышение чувствительности биоиндикации экологического состояния водного биоценоза и возможности быстрого прогнозирования ухудшения или улучшения этого состояния путем улавливания наиболее ранних признаков изменения качественно-количественного соотношения в сообществе. Способ осуществляется следующим образом:
исследуемый материал воду из водоема отбирают в стерильные флаконы батометром с поверхности и с глубины 3-й прозрачности и у дна, смешивают и получают интегрированную пробу воды. В течение 2 ч после произведенного забора проб осуществляют посев 1 мл воды, разведенной в 10-8-10-10 раз на питательную среду с добавлением лизоцима и без добавления лизоцима. В первом случае достигается выделение преимущественно антилизоцимактивных форм микроорганизмов, во втором случае общего количества и лизоцимактивных форм микробов. Питательную среду готовят следующим образом. Первым этапом является приготовление безбактериальной воды. Вода из незагрязненного водоема профильтровывается в воронке через асбестовый фильтр Зейца, под который вниз подкладывается мембранный фильтр N 3 для задерживания волокон асбеста. Воронка, приемная колба, пробирки и пипетки предварительно тщательно обрабатываются раствором 0,3 н. К2Сr2О7, приготовленным в концентрированной серной кислоте. Перед фильтрацией через асбестовый фильтр пропускают 50-100 мл кипящей дистиллированной воды для его очистки. Затем фильтруют воду из незагрязненного водоема. Приемная колба споласкивается первыми порциями безбактериальной воды. Полученную воду разливают в пробирки по 10 мл, затыкают ватными пробками с марлевыми салфетками и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. Поскольку при стерилизации в результате разрушения карбонатов нарушается ионное равновесие и вода подщелачивается, для нормального развития микроорганизмов необходимо подвести рН близко к нейтральному. Для этого пробирки ставят на 2-5 ч в эксикатор или герметический шкаф, в который помещают стакан с 5-10 г бикарбоната натрия, приливают 15-20 мл 20% -ной серной кислоты. Через 2-5 ч пробирки вынимают. Для посева лизоцимактивных форм микроорганизмов на этом этапе подготовка питательной среды заканчивается. Вторым этапом является подготовка водного раствора лизоцима в концентрации 0,5



Л М1(ЛА)/М2(АЛА)
Экологическое состояние в биоценозе оценивалось по соответствующему отношению:
Л

благополучное неблагополучное
состояние состояние
биоценоза биоценоза
Результаты проведенных исследований представлены в табл. 5. Испытания проводились дважды в течение года и захватывали паводковый период апрель-май (весна) и наиболее стабильный для биоценозов теплый период август-сентябрь (осень). В весенний период (апрель-май) на всем протяжении реки Волги с паводковыми водами поступает большое количество аллохтонного органического вещества, что приводит к значительному однообразию в водных биоценозах на различных станциях. Рассчитанный коэффициент Л(ЛА)/(АЛА) на различных станциях в этот период показал, что его величины были низкими и не превышали 1 (0,01-0,8). Осенний период (август-сентябрь) характеризовался наиболее стабильной погодой (отсутствием дождей, хорошим прогревом воды), что способствовало формированию устоявшихся биоценозов на каждой станции, поэтому любое антропогенное влияние в этот период регистрируется достаточное четко. Анализ экологического состояния осенних биоценозов в р. Волге и ее притоках по соотношению лизоцимактивных к антилизоцимактивным микроорганизмам (Л ЛА/АЛА) показал, что в местах сброса хозяйственно-бытовых и промышленных стоков, коэффициент Л был значительно меньше 1 (0,01-0,5) (ст. 1, 4, 7, 8, 10, 11), что говорит о неблагоприятном биоценозе, а на станциях, расположенных выше этих стоков или у истоков рек (ст. 2, 3, 5, 6, 9), где коэффициент Л > 1, что свидетельствует об экологическом благополучии в водных биоценозах на этих станциях. Дополнительно проведенные гигиенические исследования показали отсутствие в этих точках токсических воздействий. Таким образом, определение отношения количества лизоцимактивных форм к антилизоцимактивным формам бактерий является надежным критерием оценки состояния биоценоза. П р и м е р 2. Оценка состояния водных биоценозов в р. Урал у г. Оренбурга по уровню соотношения лизоцимактивных к антилизоцимактивным бактериям была проведена по результатам исследования проб, отобранных в июне и июле 1990 г. (табл. 6). На основании данных, представленных в таблице, видно, что на станциях, расположенных в зоне поступления стоков от населенных пунктов: (ст. 1, 2) (пионерские лагеря), с очистных сооружений (ст. 5) и у устья р. Сакмары (ст. 7)0 несущей сточные воды с Сакмарской ТЭЦ, отношение лизоцимактивных к антилизоцимактивным формам бактерий не превышало 1 и коэффициент Л колебался от 0,01 до 0,8. Таким образом, коэффициент Л меньше 1 отражает экологическое неблагополучие в биоценозах. На станциях, расположенных в зонах экологически чистых (ст. 4, 6, 8), т.е. на участках реки, не получающих антропогенные загрязнения с водосборной площади, коэффициент Л был выше 1 (от 2 до 10), что свидетельствует об экологически чистых биоценозах на этих станциях. Таким образом, определение отношения лизоцимактивных форм бактерий к антилизоцимактивным является хорошим критерием оценки состояния биоценоза. Предлагаемый способ прост в исполнении. Не требует больших затрат на подготовку лаборантов-исполнителей и позволяет ускорить получение результатов исследований, характеризующих состояние биоценоза. П р и м е р 3. Оценка состояния биоценозов р. Илек в районе Соль-Илецка по отношению лизоцимактивных к антилизоцимактивным формам бактерий (ЛА/АЛА) была проведена по результатам анализа проб, отобранных в июне и августе 1980 г. (табл. 7-8). В июне в р. Илек был осуществлен аварийный выброс хромсодержащих отходов Актюбинским заводом ферросплавов. Химический анализ проб показал превышение в воде реки содержания 3-валентного хрома в 293 раза против ПДК (0,001 мг/л). Оценки состояния биоценозов р. Илек на основании предлагаемого нами способа показала, что в биоценозе преобладали антилизоцимактивные формы над лизоцимактивными и Л был < 1 (ЛА/АЛА0,1-0,033). Оценка биоценозов р. Илек по стандартным гидробиологическим методам фиксировала в реке массовое цветение сине-зеленых водорослей, т.е. регистрировалось вторичное биологическое загрязнение. В августе содержание 3-валентного хрома снизилось до предельно допустимых концентраций (ПДК 0,001-0,003 мг.л), что естественно повлекло изменения в биоценозах реки: снизилось цветение воды, а анализ лизоцим и антилизоцимсапрофитных бактерий показал преобладание в биоценозе лизоцимактивных форм, отсюда Л (ЛА/АЛА) стало больше 1 (Л > 1). Таким образом, предлагаемый способ является весьма информативным в оценке состояния биоценоза.
Формула изобретения
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6