Способ получения 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой

 

Изобретение относится к медицине, в частности дерматологии, а именно к способу получения ₂ глубулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой. Сущность изобретения состоит в том, что разработан способ получения ₂ глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, включающий осаждение белков пузырной жидкости сульфатом аммония с последующим растворением его в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,4, далее препарат очищают методом ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, при этом отбирают фракцию, элюирующуюся в градиенте от 0,2 до 0,6 М NaCl, методом гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе 4В, отбирая фракцию в градиенте 0,6 0 М (NH₄)₂SO₄, после диализа подвергают гель - фильтрации на сефадексе G-200, собирая фракцию с мол. м. 50 70 кД и афинной хроматографии на Кон-А-агарозе, при этом целевой продукт представляет собой фракцию, элюирующуюся в диапазоне концентрации -D-гликопиранозида от 2,5 до 3,0% имеет мол. м. 60 10 кД, относительную электрофоретическую подвижность 0,83 + 0,02 и изоэлектрическую точку pI 5,25 + 0,23. На основе препарата, полученного заявляемым способом, предполагается разработать способ получения высококачественного препарата антител к нему. Антитела к ₂ -глобулину пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, предполагается использовать в качестве диагностикума истинной пузырчатки, а также для мониторинга и оценки качества проводимой терапии. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к дерматологии, а именно к способу получения ₂-глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой.

Рост заболеваемости пузырными дерматозами в мире, невыясненность механизмов отмены толерантности к мембранным антигенам шиповатых эпителиоцитов, возникновение акантолиза и эпидермо-дермального разъединения патологических процессов послужило основой для начала серии новых исследований по изучению возможностей маркирования патологических процессов при истинной пузырчатке.

В данной работе проведен анализ спектра белков пузырной жидкости больных пузырчаткой и изучение физико-химических свойств гликопротеида, ассоциированного с пузырчаткой.

Известны различные способы получения белков с электрофоретической подвижностью ₂-глобулинов из биологических материалов, например из атеросклеротически измененной стенки аорты. Способ получения этого ₂-гликопротеида представлен на следующей схеме: Ткани аорты измельчали на гомогенизаторе при 10000g и делипидировали смесью хлороформа и метанола (V₁:V₂=3:1).

Остаток лиофильно высушивали ионообменная хроматография на ДЕАЕ-52 целлюлозе Элюция 0,5 М Nа-фосфатным буфером рН 7,0 в диапазоне концентрации NaCl от 0,12-0,2 М гельфильтрация на сефадексе G-150 Элюция белковой фракции с М 8010 КД Афинная хроматография на лентил-лектин 413-сефарозе
Элюция 2,5%-ным раствором -метилдеглюкопиранозида

Препарат ₂ -гликопротеида аортальной стенки 91%-ной чистоты
Данный способ можно считать лишь одним из многочисленных аналогов заявленного метода. Прототип в доступной литературе не обнаружен, поскольку гликопротеид с электрофоретической подвижностью ₂-глобулина из пузырной жидкости получен впервые, хотя имеется некоторый опыт исследования белкового спектра пузырной жидкости.

Способ осуществляют следующим образом. В работе использовали пузырную жидкость, полученную от нескольких больных истинной пузырчаткой.

Пузырную жидкость в количестве 25 мл обрабатывают сульфатом аммония, взятым в 50% -ном насыщении, полученный осадок отделяют центрифугированием при 20000g, растворяют в 5 мл 0,05 М фосфатного буфера при рН 7,4, добавляют 5 мл охлажденного ацетона. Далее осадок отделяют центрифугированием при 20000g, растворяют в 1 мл буферного раствора и концентрируют. Концентрированный препарат подвергают очистке по следующей схеме:
ионообменная хроматография (ДЕАЕ 52 целлюлоза Watman Еngland)
Отбирают фракцию, элюирующуюся в градиенте NаCl от 0,2 до 0,6 М

Гидрофобная хроматография (Рhenyl сефароза 4В Рharmacia-LКВ)
Отбирают фракцию, элюирующуюся в градиенте сульфата аммония от 0,6 до 0 (после этого препарат диализуют и концентрируют до 1 мл)

Гель-фильтрация (сефадекс G-200, Рharmacia-LКВ)
Отбирают фракцию мол.м. 50-70 КД

Афинная хроматография (Соп-А агароза Sigma USА)
Отбирают фракцию, элюирующуюся в диапазоне концентрации -Д-гликопиранозида от 2,5 до 3,0%
При этом, ионообменную хроматографию проводят на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой (Watman, Англия), уравновешенной 0,05 М Nа-фосфатным буфером рН 7,6 (рабочий буфер) при скорости протока 40 мл/ч, гидрофобную хроматографию проводят в колонке заполненной фенил-сефарозой 4В (LКВ, Швеция), и уравновешенной рабочим буфером, содержащим 1 М сульфата аммония, при скорости протока 40 мл/ч, гель-фильтрацию осуществляют в колонке, заполненной сефадексом G-200 (Рharmacia, Швеция), уравновешенной рабочим буфером при скорости протока 5 мл/ч (для определения молекулярной массы гель-фильтрационным методом использовали стандарты фирмы Serva, Германия).

Афинную хроматографию проводят на Коп-А сефарозе 4В (Рharmacia, Швеция), уравновешенной Nа-ацетатным буфером рН 7,0, содержащим МgСl, СаСl, МnCl в концентрации 1 мМ, при скорости протока 1 мл/ч.

Регистрацию выхода белковых фракций при хроматографиях осуществляют при помощи проточного фотометра "Uvicord S" (LКВ, Швеция), с последующей иммунохимической верификацией.

Исследование аминокислотного состава проводили после гидролиза препарата 6 н. НСl в течение 12, 24 и 36 ч при 105 С на аминокислотном анализаторе "Durrum" DS-500 (USА).

Полученный очищенный препарат был использован при иммунизации кроликов породы шиншилла, с целью получения моноспецифической антисыворотки.

При анализе моноспецифической антисыворотки методом дискэлектрофореза с последующим иммунопроявлением, показано, что антисыворотка выявляет в пузырной жидкости один антиген с электрофоретической подвижностью ₂-глобулинов. Физико-химические свойства и аминокислотный состав полученного белка представлены в табл.1 и 2.

Как видно из табл.1 исследуемый белок имеет относительную мол.м. 743,6 КД, изоэлектрическую точку 4, 6 и электрофоретическую подвижность ₂-глобулинов.

В структуре белковой части преобладают пролин, глютаминовая кислота, метионин. Высокое средство с конковалином А позволяет с большей долей вероятности предполагать наличие в молекуле углеводного компонента.

Очищенный ₂-глобулин вместе с моноспецифической антисывороткой к нему был оттитрован с целью конструирования стандартной тест-системы.

Иммунохимический анализ ₂-глобулина в различных биологических жидкостях человека показал, что он является относительно специфичным для пузырной жидкости, полученной от больных истинной пузырчаткой, не определяется при этом в сыворотке крови и спиномозговой жидкости доноров.

На основе препарата, полученного предлагаемым способом, возможно разработать способ получения высококачественного препарата антител к нему. Антитела к ₂-глобулину пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, предполагается использовать в качестве диагностикума истинной пузырчатки, а также для мониторинга и оценки качества проводимой терапии.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ₂ -ГЛОБУЛИНА ПУЗЫРНОЙ ЖИДКОСТИ, АССОЦИИРОВАННОГО С ИСТИННОЙ ПУЗЫРЧАТКОЙ, включающий осаждение белков пузырной жидкости сульфатом аммония с последующим растворением его в 0,05 М фосфатном буфере pH 7,4, далее препарат очищают методом ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, при этом отбирают фракцию, элюирующуюся в градиенте от 0,2 до 0,6 М NaCl, методом гидрофобной хроматографии на фенилсефарозе 4В, отбирая фракцию в градиенте 0,6-0 М (NH₄)₂SO₄, после диализа подвергают гель-фильтрации на сефадексе G 200, собирая фракцию с мол.м. 50-70 КД и афинной хроматографии на Кон. -а агарозе, при этом целевой продукт представляет собой фракцию, элюирующуюся в диапазоне концентрации - D гликопиранозида от 2,5 до 3,0% имеет мол.м. 60 10 кД, относительную электрофоретическую подвижность 0,83 0,02 и изоэлектрическую точку pJ 5,25 0,23.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3