Раствор для консервирования энзимированных эритроцитов, используемых в изосерологических реакциях

 

Использование: в медицине, в иммуносерологии. Сущность изобретения: применяют раствор для консервирования энзимированных эритроцитов, используемых в изосерологических реакциях со следующим соотношением компонентов в смеси (г/л): аденин 1,35 - 2,70; инозин 4,00 - 8,00; лимонная кислота 14,5 - 15,0; глюкоза 55,0 - 60,0; Na₃PO₄ - 2,00 - 3,00; мертиолат натрия 0,10 - 0,15; NaOH 8,50 - 9,00. При выявлении изогемагглютининов и в пятнах крови раствор дополнительно содержит CaCl₂ в количестве 0,03 - 0,04 г/л.

Изобретение относится к медицине, именно к иммунологии.

Известны многочисленные растворы (т. н. гемоконсерванты), предназначенные для хранения цельной донорской крови, эритроцитной массы, заготавливаемых для переливания больным, питательные среды для хранения различных тканевых клеточных взвесей, а также растворы для хранения нативных (не обработанных протеазами, т. е. не энзимированных) эритроцитов.

Однако все эти растворы из-за отсутствия в них адекватных антимикробных средств, неприемлемого (слишком кислого) рН среды или присутствия веществ, например, сахарозы, маннита, тормозящих указанную реакцию, оказались непригодными для сохранения энзимированных эритроцитов.

Dale описал консервирующий раствор, специально предназначенный для хранения энзимированных (папаинизированных) эритроцитов, который и может служить прототипом заявляемому раствору.

Пропись предложенного Dale раствора следующая: Цитрат натрия трехзамещенный (Na₃C₆H₅O₇ 12H₂O) 8,0 Лимонная кислота 0,5 Глюкоза 18,66 NaCl 4,18 Инозин 10,0 H₂O До 1000,0 (мл) Папаинизированные эритроциты, сохраняемые в этом консерванте, остаются пригодными для работы в течение 2-3 недель. Однако практическое использование указанного раствора имеет ряд недостатков, в том числе и такой, общий со всеми аналогами, как отсутствие в растворе антимикробных средств, что требует при работе с ним соблюдения условий строгой асептики, которые не всегда могут быть обеспечены в практических серологических лабораториях; предложенный Dale раствор рассчитан на сохранение эритроцитов, обработанных папаином и заготавливаемых из свежеконсервированной крови, рекомендован для сохранения лишь Rh-антигенной активности папаинизированных эритроцитов; в целом все это существенно ограничивает возможности применения указанного раствора.

Целью изобретения была разработка раствора для консервирования энзимированных эритроцитов, используемых в изосерологических реакциях, обладающего более широкой областью применения, а именно обеспечивающего возможность использования стандартных по системам АВО, Rh, Lewis, Р эритроцитов крови любого способа заготовки, обработанных любой серологически активной протеазой микробного или растительного происхождения, сохраняемых и используемых в обычных, нестерильных, условиях работы серологической лаборатории.

Цель была достигнута применением нижеследующего раствора, составленного на основании многочисленных исследований с экспериментальными растворами, содержавшими различные соотношения разных ингредиентов антимикробного действия, веществ, повышающих устойчивость клеточной (эритроцитарной) мембраны, а также веществ, поддерживающих разные виды эритроцитарного метаболизма (гликолитического, фосфатного, энзиматического), при следующих соотношениях компонентов, в г/л раствора: Аденин 1,35-2,70 Инозин 4,00-8,00 Лимонная кислота 14,5-15,0 Глюкоза 55,0-60,0 Na₃PO₄ 2,00-3,00 Мертиолат натрия 0,10-0,15 NaOH 8,50-9,00 Вода дистиллированная До 1000,0 (мл) рН раствора 6,30-6,40 Для обеспечения специфичности реакции выявления изогемагглютининов <N>и в следах крови с помощью энзимированных эритроцитов при производстве судебно-медицинских экспертиз в раствор дополнительно вводят CaCl₂ в количестве 0,03-0,04 г/л.

По сравнению с прототипом заявляемый раствор отличается тем, что в него введены новые компоненты: трехзамещенный фосфат натрия, аденин, мертиолат натрия, хлористый кальций; у заявляемого раствора также новое значение рН среды 6,30-6,40, обеспечивающее наиболее длительное сохранение энзимированных эритроцитов.

Анализ известных растворов, используемых для хранения цельной донорской крови и эритроцитной массы, тканевых клеточных взвесей и нативных стандартных эритроцитов показывает, что некоторые из введенных в заявляемое решение веществ известны, например, глюкоза, лимонная кислота.

Однако только сочетание этих компонентов с экспериментально найденными другими компонентами и в иных соотношениях обеспечило раствору те новые свойства по сравнению с прототипом, которые проявляются в заявляемом решении: значительное расширение спектра антител, выявляемых консервированными энзимированными эритроцитами, повышение специфичности реакции агглютинации энзимированных эритроцитов и возможность очень важной для своевременного выяснения иммунологических причин посттрансфузионных осложнений экспресс-диагностики трансфузионно опасных антител систем Rh, Lewis, Р, существенное упрощение выполнения всех лабораторных процедур, связанных с заготовкой и использованием энзимированных эритроцитов в изосерологических реакциях, что делает доступной для рутинной практики чувствительную диагностику не только Rh-антител, как это имеет место в прототипе, а всех антител АВО-, Rh-, Lewis и Р-специфичности, выявляемых ферментными тестами.

При этом следует подчеркнуть, что составов консервантов с мертиолатом натрия неизвестно, его введение в раствор не может рассматриваться как очевидное, так как в иных дозировках он или неэффективен, или вызывает довольно быстрый гемолиз эритроцитов. Вместе с тем, в концентрации 0,10-0,15 г/л мертиолат натрия оказался не только наиболее пригодным антимикробным средством при сохранении энзимированных эритроцитов, но и веществом, улучшающим, как и хлористый кальций, специфичность реакции агглютинации энзимированных эритроцитов путем существенного ингибирования панагглютинационных свойств свежевзятых сывороток, что и позволило разработать экспресс-диагностику антител систем Rh, Lewis, P.

П р и м е р 1. Использование консервирующего раствора.

Так как колебания входящих в раствор ингредиентов невелики, приводим пропись раствора с предпочтительным весовым соотношением ингредиентов: Аденин 2,70 Инозин 8,00 Лимонная кислота 15,0 Глюкоза 60,0 Na₃PO₄ 12H₂O 2,00 Мертиолат натрия 0,10 Едкий натрий 0,85 Вода дистиллированная До 1000,0 (мл) рН раствора 6,35 Для консервирования в приведенном растворе дважды отмытые энзимированные эритроциты нужных фенотипов разделяют (в пробирках) на 2-3 части, каждую порцию заливают 9-10-кратным объемом раствора; содержимое пробирок перемешивают, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и сохраняют в холодильнике при 4-6^оС, используя каждую новую порцию эритроцитов для выявления антител в сыворотках или в качестве соответствующих эритроцитарных контролей при выявлении антигенов ферментными тестами по мере израсходования предыдущей. При этом консервированные энзимированные эритроциты полностью сохраняют свою агглютинационную активность и специфичность реакции агглютинации в течение не менее 2-3 недель.

П р и м е р 2. Практическое использование консервирующего раствора при выявлении групповых изогемагглютининов в пятнах крови.

1. Готовят консервирующий раствор согласно примеру 1.

2. К приготовленному раствору добавляют 10% -ный раствор хлористого кальция в количестве 300 мкл на 1 л раствора.

3. В приготовленном консервирующем растворе, содержащем ионы Ca⁺⁺, готовят 1% взвесь стандартных энзимированных резус-отрицательных эритроцитов групп A, B, O, которые затем используют для выявления изогемагглютининов и в следах крови методом покровного стекла (метод Ляттеса) по описанной технике [4] . Применение взвеси энзимированных эритроцитов в заявляемом растворе обеспечивает полную специфичность реакции выявления групповых изогемагглютининов при судебно-медицинском исследовании даже свежеобразованных пятен крови.

Формула изобретения

1. РАСТВОР ДЛЯ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭНЗИМИРОВАННЫХ ЭРИТРОЦИТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ИЗОСЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ, содержащий лимонную кислоту, глюкозу, инозин, отличающийся тем, что, с целью расширения области применения, раствор дополнительно содержит аденин, Na₃PO₄, мертиолат натрия NaOH при следующем соотношении компонентов в смеси, г/л: Аденин 1,35 - 2,70 Инозин 4,00 - 8,00 Лимонная кислота 14,5 - 15,0
Глюкоза 55,0 - 60,0
Na₃PO₄ 2,00 - 3,00
Мертиолат натрия 0,10 - 0,15
NaOH 8,50 - 9,00
2. Раствор по п. 1, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения при выявлении изогемагглютининов и , в пятнах крови раствор дополнительно содержит CaCl₂ в количестве 0,03 - 0,04 г/л.