Способ определения концентрации ионизированного @ в цитоплазме живых клеток

 

Использование: медицина, биохимия для определения Са+ в цитоплазме клетки. Цель: увеличение производительности исследования экономное расходование исследуемого материала, расширение использования и упрощение способа Сущность изобретения: способ проводят в объединенных в стрипы микрокюветах, измерения проводят на флуариметре, проба содержит компоненты в объемном соотношении суспензия клеток: стимулирующий фактор: детергент буфер 42:1 до-40.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ИАТЕЙТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (2Ц 4922129/14 (22) 29.03.91 (46) 30.1093 Ьол. Nc 39-40

P tj Военно-медицинская академия имСМ.Кирова (72) Яковлев ГМ; Карлов ВА; Дикань В.Е (УЗ}Дикань Вячеслав Евгеньевич (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ

ИОНИЗИРОВАМНОГО Са В ЦИТОВЛАЗМЕ

ЖИВЫХ КЛЕТОК (57} Использование: медицина, биохимия, для опре(щ Щ (и) 200226б С1 (Я) 5 G 01 N 33 53 деления Са в цитоплазме клетки Цепь: увепиче+2 ние производительности исследований, экономное расходование исследуемого материала, расширение использования и упрощение способа Сущность изобретения: способ проводят в объединенных в стрипы микрокюветах, измерения проводят на фпуариметре, проба содержит компоненты в объемном соотношении суспензия клеток стимупиру ощий фактор: детергент: буфер = 42:1 до.40.

2002266

Изобретение относится к области медицины, в частности к биохимии, и может быть использованодля измерения концентрации ионизированного Са 2 в цитоплазме живой клетки. 5

Известны способы определения концентрации ионизированного Са с использованием фотобелка медузы аквеорина, который люминесцирует. п2ри взаимодейстa9lH с ионизированным Ca+ . Ho данный cfloсоб обладает рядом существенных недостатков, главными из которых являются проницаемость мембраны для белка и, следовательно, трудоемкость способа.

Наиболее близким техническим реше- "5 нием к заявляемому является способ определения концентрации ионизированного

Са+2 с использованием флуоресцентного деривата EGTA, хелатора Са quin-2АМ, Эфирную форму этого зонда добавляют к 20 суспензии клеток, благодаря этому зонд беспрепятственно проходит через мембрану в клетку, где неспецифические эстеразы гидролизуют эфир в его кислоту, которая образует хелатные комплексы с ионом Са

+2 что вызывает увеличение флуоресценции, Известен также способ, заключающийся в следующем (Гуковская A. С., "Роль ионтранспортирующих систем и вторичных мессенжеров в трансмембранной передаче сигнала в лимфоцитах", дак.дисс.);.

Подготовительный этап.

Тимоциты выделяют путем измельчения тимуса крыс Я1этаг„ продавливания через нейлоновый фильтр и отмывки центрифугироввнием доводят до рабочей концентрации 5 10 кл/мл. >Кизнеспособность клеток оценивают поглощением трипанового синего. В процессе выделения клетки инкубируют в среде 199. Перед опытом клетки 40 переводят в стандартный солевой буфер, содержащий 5,5 mM КС1, 130 mM йа С1, 1 mM

Иа2НРО4, 1 тМ КН2РО4, 4 еМ йаНСОз, 1,3

mM СаО2, 10mM НЕРЕ$, 6глМ глюкозы, рН

7,1 — 7.". Клетки нагружают красителем quin2АМ (рабочая концентрация 15 мкМ), инкубируют 40 мин при 37 С, отмывают от красителя и помещают в стандартный солевой буфер, Измерения. 50

Суспензию клеток помещают в термостатируемую кювету и измеряют флуорес, центный сигнал на специально сконструированной (B. П. Зинченко, ИБФ

АН СССР) установке, представляющей со- 55 бой комплекс спектрофлуориметра и термостатируемой ячейки. зонд-объектив погружается прямо в суспензию клеток, которая постоянно перемешивается магнитнрй мешалкой.

Но данный способ обладает рядом существенных недостатков: технически не выполним в условиях клиники (промышленностью не выпускается, в единственном экземпляре существуют в ИБФ АН

СССР); — способ не экономичен в отношении исследуемого материала; — ограниченность практического применения в клинике из-за сложности способа и технического обслуживания аппаратуры.

Цель изобретения — увеличить производительность исследований, повысить точность измерений, экономно расходовать исследуемый материал, расширить практическое использование и упростить способ.

Цель достигается тем, что после выполнения подготовительного этапа определение производят в обьединенных в стрипы микрокюветах, соблюдая при этом строго определенную последовательность их заполнения, объемные соотношения .вносимых ингредиентов, температурный и временной режим; расчет концентрации ионизированного Са производят по фор-.2 муле: где Fpp — интенсивность флуоресценции опытной пробы;

F<>« — интенсивность флуоресценции опытной пробы после стимуляции;

F»H — учет самофлуоресценции пробы, Рмин = 1/6 Рма«

К вЂ” коэффициент диссоциации g uin-2AM при 20 С;

400 — коэффициент пересчета на количество клеток в каждой микрокювете.

Способ выполняется следующим образом.

Подготовительный этап:

Мононуклеары периферической крови выделяют на градиенте плотности фиколлверографин, отмывают центрифугированием с 0,2%-ным раствором ЗДТА от тромбоцитов, Подсчет выделенных клеток проводят в камере Горяева по общепринятой методике, )Кизнеспособность клеток оценивают по поглощению 0,2 j,— ного рас,— твора трипанового синего. Выделенные лимфоциты разводят 0,9 /-ным раствором

NaCi до рабочей концентрации 20 млн/мл.

1 мл этой суспензии клеток нагружают 1 мкл

15 mM раствора qufn-2AM. Окрашенные клетки инкубируют 40 мин при 37 С, после чего отмывают центрифугированием и помещают в стандартный солевой буфер (ССБ), 2002266

Порядок заполнения микрокювет, режимы.

В первый триполь вносят 20-мкл суспенэии лимфоцитов и 180 мкл ССБ; в третий—

20 мкл суспензии лимфоцитов и 175 мкл

ССБ; в третий — 20 мкл суспензии лимфоцитов, 10 мкл стимулирующего фактора (например, 10 мкл стандарта Радуга в концентрации 100 ng/ml, производства

"Seragen", США) и 165 мкл ССБ.

Микрокюветы с внесенными ингредиентами инкубируют при постоянном помешивании 15 мин при 20 С, после чего ва второй и третий трипли вносят 5 мкл 1 М раствора дигитонина, микрокюветы повторно инкубируют в том же режиме 5 мин.

Измерения.

Проводят в трипле на флуориметре в микрокюветах по программе: flash rate, 1,00

ms, delay time 0,02 ms, window time 0,50 ms, deal time 10 ns.

В отличии от прототипа определение проводят в объединенных в стрипы микрокюветах, соблюдая при этом определенную последовательность их заполнения, обьемные соотношения вносимых ингредиентов; температурный и временной режимы; рас.Я чет концентрации ионизированного Са проводят по формуле, где в отличии от прототипа коэффициент диссациации quin-2AM (К) взят для 20 С (из расчета на температуру окружающей среды) и количество клеток в каждой микрокювете равно 400 тыс. Это говорит о соответствии заявляемого решения критерию "новизны".

Новые признаки. введенные в способ, никогда ранее в биохимии для достижения поставленной цели не применялись, что говарит о соответствии заявляемого решения критерию "существенные отличия".

Введение новых признаков в заявляемое решение позволит получить новый положительный эффект, увеличить производительность исследований, повысить точность измерений, расширить практическое использование, упростить способ и экономно расходовать исследуемый материал.

fl р и м е р. Больной Карпушин И. А., история болезни М 57370. поступил в клинику кардиологии ВМедА им. С. M. Кирова

26.11.90 г„ с диагнозом: гипертоническая болезнь 1 стадии.

1. 05.12.90 г. произведен забор веназной крови в количестве 20 мл. Выделена 33 млн/мл лимфоцитов. Процент нежизнеспособных клеток составил 3%. Приготовлено

1,53 мл рабочей суспензии лимфоцитов. Па стандартной схеме клетки нагружены зондам, отмыты и внесены в микраюкюветы.

Измерения проведены в трипле. Результаты: концентрация внутриклеточного ионизированного Са составила 0,051 мкМ, +г концентрация внутриклеточного ионизированнага Са после стимуляции лимфа+г цитав PgFza 0,043 мкМ.

05.12.90 r, проведена функциональная проба с солевой нагрузкой (10 -ным раствором NaCf. внутривенно, капельно, 100 мл). Через 3 ч после пробы проведен забор

20 мл венозной крови. Выделено 9 млн/мл лимфоцитов, Процент нежизнеспособных клеток составил 5 Приготовлено 0,43 мл рабочей суспензии лимфоцитов. По стан-. дартной схеме клетки нагружены зондом, отмыты и внесены в микрокюветы, Измерения проведены в трипле. Результаты: концентрация внутриклеточного ионизированного Са 0,069 мкМ. концентрация внутриклеточного иониэированного Са после стимуляции лимфоцитов PgFz> — 0,056 мкМ.

12.12.90 r. после проведенного курса терапии прозазином (по 0,001 г, 3 раза в день, рег os, 7 дней) произведен забор 20 мл веноэной крови. Выделено 12.,5 млн/мл лимфоцитов, Процент нежизнеспособных. клеток составил 3 . Приготовлено 0,6 мл рабочей суспензии лимфоцитов, По стандартной схеме клетки нагружены зондом, отмыты и внесены в микрокюветы. Измерения проведены в трипле. Результаты: концентрация внутриклеточного ионизированного Са 0,094 мкМ, концентрация внутриклетачного ионизированного Са после стимуляции лимфоцитов Р9Еь — 0,097 мкМ.

1, Расширение практического использования способа и повышение точности измерений наглядно показано в приведенных примерах. Динамика содержания ионизираваннаго Са в цитаплазме лимфоцитов

{0,051 мкМ до долевой нагрузки, 0,069 мкМ после солевой нагрузки. 0.094 после курса терапии прозазином) и в цитоплазме лимфацитов, стимулированных Р9Ег (0,043 мкМ до солевой нагрузки. 0,056 мкМ после солевой нагрузки, 0,097 после курса терапии прозазином), позволяет оценить: — чувствительность рецепторов клеток хозяина к

PgFza до солевой нагрузки, после нее и после терапии; — толерантность к солевой нагрузке, имеющей важное практическое значение при гипертонической болеэни;— проводимую терапию.

Это имеет важное практическое значение в изучении патогенеза болезни и в выборе терапии (на примере гипертонической болезни).

2002266

Составитель 8. Дикань

Техред М,Моргентал Корректор С. Юско. Редактор A. Бер

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3172

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

2. Увеличение производительности исследований и упрощение способа осуществляется в основном за счет использования обьединенных в стрипы микрокювет, что значительно облегчает и ускоряет работу исследователя.

3. Экономия исследуемого материала (венозной крови) производится путем заполнения микрокювет по стандартной схеФормула изобретения

GlOCQB ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНИЗИРОВАННОГО Са 8 ЦИТОПЛАЗМЕ ЖИВЫХ КЛЕТОК, включающий выделение.клеток, нагрузку зондом, отмывку и измерение фпуоресценции, отличающийся тем, что, с целью увеличения производительности исследований, повышения точности измерений, экономного расходования исследуемого материала, расширения практического использования и упрощения способа, определение провоме и с использованием малых объемов (20 мкл суспензии лимфоцитов).

Способ высоко производитепен, экономичен в отношении расходования исспедуе5 мого материала и реактивов, прост и доступен в исполнении и может быть рекомендован специалистам для широкого практического применения. (5S) 3. Nature, 1981. t.îîdîï 290, р, 527 528.

10 дят в обьединенных в стрипы микрокювев парвыи триппь которых вносят суспензию. клеток, во второй - суспензию клеток и детергент, в третий - суспензию клеток, стимулирующий фактор и детергент, объем всех триплей доводят буфером до 200 мкл, при этом клетки инкубируют со стимулирующим фактором 15 мин, после

20 добавления детергена - еще 5 мин при

20 С, соблюдая во всех триплях обьемное соотношение суспензия клеток: стимулирующий фактор: детергент: буфер 4: 2: 1 -, 40.