Способ твердофазного культивирования мицелиальных грибов

 

21) 4841 529/1 3

22) 19.06.90 "

46) 30.12.93 Бюл. Иа 48 — 47

71) Воронежский технологический институт

72) Антипова Л.В.

54) СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИ9ВАНИЯ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ

57) Использование: биотехнология. Сущность зобретения: с целью повышения выхода биомассы упрощения способа грибы Rhizopus pygmanes р1 — 8 и Rhizapus oryzsi 1362 — 284 выращивают путем периодического наслаивания питательной среды, содержащей пшеничные отруби, через каждые 20 — 22 ч до достижения высоты слоя 7 — 8 см при общей продолжительности процесса 120 — 124 ч

Предлагаемый способ позволяет сэкономить по-, севной материал в 4 — 5 раз, а также увеличить выход биомассы в 2,5 — 3,0 раза при одинаковом уровне биохимической активности мицелиальных грибов по сравнению с известным способом. 2 табл.

1839183

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение при получении целевых ферментов в процессе выращивания на твердой питательной среде.

Известны способы поверхностного выращивания микромицетов на твердой питательной среде. включающей пшеничные отруби с добавлением добавок — индукторов .биосинтеза и добавок-рыхлителей для повышения выхода целевых продуктов (1).

° Недостатком этого способа является невозможность. значительно увеличить выход ферментов из-эа ограниченности высоты, питательного слоя, затрудняющего аэрирование культур.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является кюветный способ твердофазного культивирования ми целиальных грибов, включающий стерилизацию увлажненных до 58-68 пшеничных отрубей (возможно добавление 5-20 $ до-, бавок-рыхлителей), инокулирование посевным материалом с содержанием спор не менее 0;7 млрд. в 1 r, тщательное перемеши-. вание. компонентов, раскладывание в кюве.ты высотой слоя 2-2,5 см и выращивание культур в течение 32-48 ч (в зависимости от индивидуальных особенностей микроорга низма) при температуре 30-35ОС (в зависимости от термофильности культуры), при периодической продувке стерильным воздухом с целью аэрироаания, уборку камеры, обработку ее формалином, аммиаком, паром (2).

Основным недостатком такого способа является недостаточно высокий выход продукта.

Целью изобретения является повышеwe выхода биомассы.

Это достигается тем, что в способе, предусматривающем стерилизацию увлажненных пшеничных отрубей, инокуляцию их посевным материалом, перемешивание, раскладывание полученной смеси в кюветы и выращивание, в качестве посевного материала используют грибы рода Rhlzopus, а в процессе выращивания периодически. через каждые 20-22 ч наслаивают свежие увлажненные пшеничные отруби толщиной в 1,52,0 см до достижения конечной толщины слоев 7-8 см и процесс выращивания ведут в течение 120-124 ч.

Способ заключается в следующем.

Кюветы для поверхностного выращивания микроорганизмов размером 40х75 см с высотой бортов 12 см и отверстиями для аэрироаания культуры моют, обрабатывают формалином, аммиаком и паром. Пшеничные отруби увлажняют до 58-65 ф, стерилиэуют в течение 1-1,5 ч при 0,15 МПа. охлаждают и при температуре 40-45 С вносят посевной материал (например, культуры микромицетов Rhlzopus pygmaues p>-s u

Rhlzopus oryzae 1384-262 на пшеничных отрубях с содержанием спор не менее 0,7 млрд. на 1 г) в количестве 1-2 к обьему питательной среды. Смесь тщательно и быстро .перемешивают, при этом конечная

10 температура смеси должна быть 30-32 C.

Полученную смесь раскладывают в кюветы слоем 2-2,5 см, При использовании более тонкого слоя происходит быстрое подсыхание твердофазной питательной среды,.а при

15 толщине слоя более 2:.5 см наблюдаются недостаточно равйомерное . прорастание спор в процессе роста, снижение аэрации культуры.

Проращивание культуры ведут при тем20 пературе 30-32ОС (наиболее характерные условия для микромицетов) в течение 20-22 ч, Время проращивания 20-22 ч характеризуется особым физиологическим состоянием культуры. К этому времени она находится

25 в экспоненциальной фазе развития, которая

:характеризуется высокой скоростьв размйожения и началом формирования комплекса экзогенных ферментов, которые являются целевыми продуктами. Время ме30 нее 20 ч недостаточно для вызревания, достижения наибольшей скорости . размножения и развития продуцентоа.

Время выращивания более 22 ч приводит к резкому снижению скорости размно35 жения клеток на фоне роста их биохимической активности.

Через 20-22 ч проращивания на твердую поверхность среды наслаивают новый питательный слой — отстерилизованные ув40 лажненные пшеничные отруби высотой 1,52,0 см, поддерживая температуру культивирования постоянной (30-32 С).

Операцию аналогично повторяют несколько раз до достижения общей высоты питатель45 ного слоя 7-8 см. Использование высоты питательного слоя менее 7-8 см не вполне отвечает поставленной цели из-за экономических соображений, а высота слоя более

7-8 см нежелательна в связи с превалирова50 нием старения культуры, снижением ее аэрации, значительным накоплением продуктов биохимической деятельности продуцентов.

Рекомендуемая общая продолжитель55 ность выращивания 120-124 ч установлена экспериментально и связана также с изменением физиологической активности культуры и снижением возможности к аэрации, При меньшей продолжи|е,н, encl«выращивания при испольэовал«««нэ..:n;;«n;; чя не183Q183

Z5

30 возможно достичь нужной высоты слоя, а .;следовательно, значительно повысить выГ. ход продукта с единицы рабочей поверхности, При этом культура не имеет нужного, уровня активности ферментов. Время выра,щивания более 124 ч нецелесообразно в связи со старением культуры и снижением выхода активной биомассы.

Пример 1. 1 кг пшеничных отрубей, среднего помола с крахмалистостью 18 ф, увлажняют водопроводной водой до конечной влажности 63, стерилизуют в автокла, ве при 0,15 МПа в течение 1 ч. Подготовленные отруби охлаждают до 40, 45ОС, инокулируют посевным материалом мицелиальных грибов Rhlzopus (27 к массе увлажненных отрубей с содержанием спор 0,7 млрд на 1 г), тщательно перемешивают и раскладывают .в кюветы (размером

20х40х12 см) высотой 2 см. Накрывают крышкой и ведут выращивание в течение 20 ч при 30 С. Затем наслаивают на проросшую в питательной среде новую партию аналогично подготовленных отрубей высотой 1,5 см, поддерживая температуру постоянной (30 С). Операцию повторяют через

40, 60 и 80 ч от начала выращивания. Куль. тивирование продолжают до достижения . общей продолжительности 120 ч, затем поверхностную культуру на пшеничных отру, бях извлекают из кюветы и определяют качество биомассы по уровню глюкоамилазной (ГлА) и протеолитической (ПА) активности, а кювету обрабатывают.

Пример 2. 1 кг пшеничных отрубей среднего помола, крахмалистостью 18 $ увлажняют водопроводной водой до конечной влажности 63, стерилиэуют в автоклаве при 0,15 МПа в течение 1 ч. Отстерилизованные отруби охлаждают и вносят посевной материал. Смесь тщательно перемешивают и раскладывают в кюветы высотой слоя 2,5 см. Накрывают крышкой и ведут выращивание 20 ч. Затем новый питательный слой 1,5 45 см наслаивают на проросшую культуру, . Операцию повторяют через 40, 60, 80 ч(при, общей продолжительности культивирова-- 44 ния 120 ч. Затем культуру извлекают, опре- " деляют качество биомассы и используют по 50 . назначению. Кюветы обрабатывают.

Пример 3. Пшеничные отруби предварительно готовят аналогично примерам 1, 2, раскладывают в кюветы высотой слоя 3.0 см. Накрывают крышкой и ведут выращива- 55 ние в течение 20 ч. Операцию повторяют через 40, 60, 80 ч от начала выращивания, наслаивая сверху пшеничные отруби высо той 1,5 см, По истечении общего времени выращивания 120 ч культуру снимают, определяют качество биомассы и используют, а кюветы обрабатывают.

Пример 4. Пшеничные отруби (по примерам 1, 2) раскладывают в кюветы высотой слоя 2,2 см. Проращивание ведут в течение 21 ч, а затем операцию повторяют через 42, 63, 84 ч от начала выращивания, выдерживая каждый раз высоту слоя 1.3 см.

По истечении 124 ч от начала процесса культуру снимают, определяют качество биомассы и используют.

Пример 5. Инокулированные пшеничные отруби(по примерам 1, 2) раскладывают в кюветы высотой слоя 2 см и проращивают в течение 22 ч. Операцию повторяют через

44, 66 и 88 ч при высоте каждого слоя 1,5 см и после последнего наслаивания ведут доращивание до общей продолжительности

128 ч, затем поверхностную культуру извлекают из кюветы, определяют активность биомассы и используют.

Пример 6. Инокулированные пшеничные отруби (по примерам 1, 2) раскладывают в кюветы высотой слоя 2 см и проращивают в течение 22 ч. Операцию повторяют через

44, 66 и 88 ч при высоте каждого слоя 1 см.

Затем культуру доращивают до общей продолжительнбсти процесса 124 ч. Далее поступают, как в вышеприведенных примерах.

Зкснерщиентальные данные.по примерам 1 — 6 приведены в табл. 1. Опытные данные приведены для Rhlzopus pygmaues p>-8 — продуцента глюкоамилаэы и протеолитических ферментов. Аналогичная зависимость. отмечена и для Rhtzopus oryzae

1362-284.

Предлагаемое техническое решение имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом: снижение трудоемкости эа счет снятия операций по обработке кювет, подготовке посевного материала и ручного труда по раскпадыванию инокулированной питательной среды. Для получения одного и того же количества культуры по прототипу при рекомендуемой высоте слоя 2-2,5 см производственный цикл необходимо повторить 34 раза со всеми операциями по подготовке кювет, помещений, посевного материала, основного выращивания; экономия посевного материала в 4-5 раза, так как для осуществления способа по прототипу каждый производственный цикл потребует расход посевного материала 1-2 (к массе увлажненных отрубей, по предлагаемому техническому решению посевной материал используется один раэ лишь на первой стадии; увеличение выхода готового продукта (поверхностной культуры) в 2,5-3,0 раза с

1839183

Таблица1

10 единицы растильной площади при практически одинаковом уровне биохимической активности мицелиальных грибов.

Общая сравнительная характери- 5

4 стика обоих способов представлена в табл. 2.

4 (56) Жеребцов H. А„Щеблыкина Л. В. Культивирование плесневого гриба Rhlzopus

pygrnaues р -е на твердых питательных средах. Микробиологическая промышленность, — 1972, вып. 2, с. 31.

Грачева И. M. Технология ферментных препаратов. M.: ВО "Агропромиздат", 1987.

1839183

Таблица2

Значение показателей

Показатели по предлагаемому техническому решепо прототипу нию

Обработка формалиОбработка формалином, аммиаком, па0,15 МПа в течение 1 ч, МЧ58-68

20-22, 2-2,5

7 — 8

6,0 — 6.3

17- 17,5

20-19

17,6 -18,2

20-19

Гл А

ПС с целью .повышения выхода биомассы, в качестве посевного материала используют грибы рода Яйгорвв, в процессе выращивания периодически через каждые 20 - 22 ч наслаивают свежие увлажненные пшеничные отруби толщиной в 1,5 - 2 см до достижения конечной толщины слоев 7 - В см и процесс выращивания ведут в течение 120

- 124 ч.

Формула изобретения. Составитель Л.Антипова

Техред М.Моргентал Корректору Л.Ливринц редактор Л.Павлова

Заказ 3403

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113g35, Москва, Ж 35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

1, Перечень технологических операций процесса для получения. аналогичного количества поверхностной культуры: подготовка кювет, стерилизация и увлажнение отрубей

2. Инокулирование посевным материалом

3. Выращивание, ч.

4. Съем культуры е 5. Обработка, мойка кювет

6; Стерилизация и увлажнение отрубей

7. Инокулирование посевным материалом

8. Выращивание, ч

9. Далее процессы повторяется 3 раза, 10. Высота слоя, см

11; Выход продукта (поверхностной культуры с единицы растильной площади), кг/см

12. Биохимическая активность, ед/г:

ПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИИРОВАНИЯ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ, редусматривающий стерилизацию увлаженных пшеничных отрубей,:., инокуляцию х посевным материалбм, перемешивание, аскладывание полученной смеси в кювеы и выращивание, отличающийся тЕМ; что, ном, аммиаком, пароьг6,!5МПа в течение 1 ч, Ф*. 58-68$

1-2 ф к массе отрубей

36-42

Вручную

Вручную

0,15 МПа в течение 1 ч, 8-68

1-2 к массе отрубей

36-42 ром 0,15 МПа в течение 1 ч, М/58-68ф

1-2 к массе отрубей

20-22