Способ подготовки гистологического препарата для выявления нервных волокон на срезах ткани

 

Использование: в медицине, а именно в гистологии и патологической анатомии, и может применяться для выявления нервных волокон в парафиновых срезах ткани. Сущность изобретения: проводят фиксацию ткани , изготовление парафиновых срезов, импрегнацию среза 10-20% раствором нитрата серебра с последующим обесцвечиванием фона среза 0,1% раствором хлорного золота , обезвоживанием и заключением в бальзам . При этом фиксацию исследуемой ткани проводят 10% раствором нейтрального формалина в течение 2 суток, а импрегнацию осуществляют накалыванием 10-28% раствора нитрата серебра на-срез в количестве 0,5-1,0 мл с инкубацией при t - 37°С в чашках Петри в течение 60-120 мин с последующим обесцвечиванием фона среза накапыванием раствора хлорного золота в количестве 0,5-1,0 мл в чашке Петри. Способ позволяет снизить токсичность метода путем исключения использования пиридина , упростить способ, сэкономить дорогостоящие реактивы и сократить время импрегнации, 1 ил. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю 6 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР е (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сл) (Л (Л

ЬЭ )>

Способ-прототип

Предлагаемый способ

Фиксация:

Жидкость Лилли. 100 мл, 4-12 ч. Формалин 10%, 100 мл, 12 — 48 ч

Промывка в водопроводной воде

2 — бч 6-24 ч

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4890971/14 (22) 17.12.90 (46) 23.08.93. Бюл. М 31 (71) Нижегородский медицинский институт им. С.M. Кирова (72) И,Е.Скворцова (56) Коломийцев А.К. и др. Быстрый метод импрегнации аэотнокислым серебром элементов периферической нервной системы, пригодной для целлоидиновых и парафиновых срезов, Архив анатомии, 1981, М 8, с.

93 — 96. (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ

НЕРВНЫХ ВОЛОКОН НА СРЕЗАХ ТКАНИ (57) Использование: в медицине, а именно в гистологии и патологической анатомии. и может применяться для выявления нервных волокон в парафиновы срезах ткани. Сущность изобретения: проводят фиксацию ткаИзобретение относится к медицине и биологии, а именно — к морфологии и может применяться при проведении морфогистохимических исследований для выявления нервных волокон в парафиновых срезах ткани.

За прототип предлагаемого способа выбран известный способ выявления нервных волокон в парафиновых срезах ткани, включающий фиксацию материала раствором, .. Ж 1835512 А1 ни, изготовление парафиновых срезов, импрегнацию среза 10 — 20 раствором нитрата серебра с последующим обесцвечиванием фона среза 0,1% раствором хлорного золота, обезвоживанием и заключением в бальзам. При этом фиксацию исследуемой ткани проводят 10% раствором нейтрального формалина в течение 2 суток, а импрегнацию осуществляют накапыванием 10 — 28% раствора нитрата серебра на срез в количестве 0,5 — 1,0 мл с инкубацией при t — 370C в чашках Петри в течение 60 — 120 мин с последующим обесцвечиванием фона среза накапыванием раствора хлорного золота в количестве 0,5 — 1,0 мл в чашке Петри. Способ позволяет снизить токсичность метода путем исключения использования пиридина, упростить способ, сэкономить дорого- З стоящие реактивы и сократить время, импрегнации. 1 ил, содержащим формалин, импрегнацию срезов 20% раствором нитрата серебра и обесцвечивание фона 0,1% раствором хлорного золота.

В полном виде, поскольку процесс подготовки кусочка ткани к заливке в парафин одинаков (стандартен) для любого дальнейшего.способа окраски, способ-прототип и предлагаемый способ включают в себя следующие этапы:

1835512

Изготовление парафиновых блоков

100мл, 1ч

100 мл, 1 ч

100 мл, 1 ч

100мл, 1 ч

100мл, 1 ч

Спирт 50"

Спирт 60

Спирт 70

Спирт 80

Спирт 96

100 мл, 1 ч

100 мл, 1 ч

100 Mn, 1 ч

100 мл, 1ч

100мл,1ч

100 мл. 1 ч

Абсолютный спирт 1

Абс. спирт f I

Хлороформ 1

Хлороформ 1I

100мл, 1 ч

100 мл. 1 ч

100 мл, 1ч

100 мл, 1 ч

Абс, спирт f I

Хлороформ 1

Хлороформ l f

Хлороформпарафин

100 мл, 1ч

100мл, 1ч

100мл, 1ч

50мл,1ч

50мл, 1 ч

50мл,Зч, 50мл,Зч парафин 1 парафин I I заливка в парафин

50 мл,Зч

50мл,З ч

50 мл, 15 мин

50 мл, 15 мин

20 мин

Импрегнация:

20 мин

1-6 ч

Депарафинирование обработка в пиридине

2 — 4ч

40 мин проточная вода дист. вода

10-20 р-р нитрата ь

20-30 мл, 12 ч

60 мл, 15

25-30 мл, 2 серебра

1 кислый формалин аммиакат серебра

0,5 кислый формалин с глюкозой

20 мл, 1 мин

20 мл, 2 мин аммиачная вода дист, вода

60 мл, 15 надсернокислый аммоний

Сульфит натрия дист. вода

° 20мл, 1ч

20 мл, 5 мин

20мл, 10 мин

20 мл, 1 мин

20 мл, 2 мин аммиачная вода

Дист. вода

Надсернокислый аммоний хлорное золото ги посул ьфит дист. вода заключение в бальзам

20мл, 1 ч

1 мл, 15 мин

20 мл, 1,мин

20 мл, 5 мин сульфит натрия дист. вода

20 мл, 10 мин

20 мл, 10 мин

20 мин

25 — 30 мл, 15 мин

20 мл, 1 мин

20мл,5 мин хлорное золото гипосульФтит дист. вода заключение в бальзам

20 мин та-гистолога, целесообразно удлинить время на этих этапах так, как указано в заявке, без ущерба для результата импрегнации. В способе-прототипе указывается чистое вре5 мя методики, без учета по крайней мере трех перерывов между рабочими днями (36 ч). T.î., полное время обработки кусочка ткани от забора материала до заключения в бальзам в способе-прототипе наименьшее—

10 40ч (+36 ч), наибольшее -53 ч(+36 ч), Время импрегнации наименьшее — 24 ч 10 мин.

Представляя сравнение двух способов по расходу реактивов и затраченному времени, автор считает необходимым дополнить следующее. По литературным данным и из практики хорошо известно, что наименьшее время фиксации — 12 ч, а минимальное время промывки — 6 ч. В предлагаемом способе также можно.фикси1 ровать 12 ч, промывать после фиксации 6 ч, но исходя из практических соображений, в частности -часового рабочего дня лаборанСпирт 50

Спирт 60О

Спирт 70

Спирт 80

Спирт 96

Абсолютный спирт 1

Хлороформ парафин парафин 1 парафин II заливка в парафин

Депарафинирование

20 р-р нитрата серебра.

1 кислый формалин аммиакат серебра.

0,5 кислый формалин

1мл,1 — 2ч

60мл, 15 мин

1 мл,2 мин г

60 мл, 15 мин

1835512

55 наибольшее — 37 ч 10 мин. В предлагаемом способе полное время обработки наименьшее — 37 ч, наибольшее — 82 ч 5 мин. Время импрегнации наименьшее — 3 ч 55 мин, наибольшее — 4 ч 55 мин. Очевидно. что в предлагаемом способе затраченное время меньше.

Из представленного сравнения также видно, что в обоих случаях гистологический материал подвергался одним и тем же этапам обезвоживания, уплотнения и заливки в парафин, и, что соответственно, расход таких реактивов как спирт, хлороформ, ксилол, парафин одинаков. Но на этапах импрегнации при прочих равных условиях, такие дорогостоящие реактивы как нитрат серебра и золотохлористоводородная кислота в предлагаемом способе используются в 25 — 30 раз меньше. При стоимости золотохлористоводородной кислоты 565-00 руб/кг и нитрата серебра 148-00 руб/кг это достаТОЧНО ЭКОНОМИЧНО.

Упрощение предлагаемого способа заключается в том, что процесс импрегнации не зависит от подготовительных этапов от фиксации до заливки в парафин и может быть применен на архивном материале, т.е. парафиновых блоках, приготовленных много раньше. Кроме того, за счет исключения токсичного вещества, не требуется специального оборудования и средств защиты, необходимых при работе с ядовитыми веществами.

Неудобство способа-прототипа состоит также в том, что предлагаемая фиксация требует специального приготовления жидкости Лилли. Особенно нежелательным является использование пиридина, представляющего собой токсичное, раздражающее и фотосенсибилизирующее вещество, вызывающее воспаление кожи с сильным жжением и образованием трещин. Кроме того, проведЪние импрегнации в биологических стаканчиках требует частой смены реактивов после 4 — 6 стекол, что увеличивает расход таких дорогостоящих реактивов, как азотнокислое серебро и хлорное золото.

Целью предлагаемого изобретения является снижение токсичности способа путем исключения. использования пиридина, упрощение способа, экономия дорогостоящих реактивов, сокращение времени и

" возможность импрегнировать архивный материал.

Поставленная цель в способе подготовки гистологического препарата для выявления нервных волокон на парафиновых срезах ткани, включающим фиксацию материала раствором, содержащим формалин, импрегнацию среза 20% раствором нитрата серебра и обесцвечивание фона 0,1 раствором хлорного золота, достигается тем. что фиксацию проводят 107, раствором нейтрального формалина в течение 2 суток, 5 импрегнацию — раствором нитрата серебра проводят в закрытых чашках Петри с инкубацией в термостате при 37 С (т,н. "влажная камера") в течение 60 — 120 мин, обесцвечивание проводят путем создания такой же

10 "влажной камеры" с использованием 1 мл

0,1 раствора хлорного золота, Предлагаемый способ имеет 5 отличительных от прототипа признаков. Все отличительные признаки существенны для

15 достйжения поставленной цели — ликвидация или замена какого-либо признака приведет к изменению положительного эффекта. Это доказано экспериментально.

Первый отличительный признак — про20 ведение фиксации в 10 растворе нейтрального формалина в течение 2 сут. 8 прототипе фиксацию проводят в жидкости

Лилли. Вообще применения 10ф, нейтрального формалина для парафиновых срезов

25 нервной ткани в доступной нам литературе не обнаружено. Полученные нами результаты показали, что фиксация в 10Я, нейтральном формалине в течение 2 сут вполне достаточна и дает хорошие результаты имп30 регнации.

Второе отличие предлагаемого способа заключается в том, что импрегнацию серебром проводят в плотно закрытых лейкопластырем чашках Петри (т.н. "влажная

35 камера") в термостате при 37 С в течение

60-120 мин. Инкубацию проводят в 20 растворе нитрата серебра при 37 С в термостате, в чашках Петри, накапыванием реактива на срез (0,5-1,0 мл); Концентрация

40 реактива выбрана как наиболее часто рекомендованная другими авторами, Время и условия инкубации подбирались эмпирически.

В процессе поиска оптимальных результатов проводилась инкубация срезов от

30 мин до 48 ч. Полученные результаты показали, что оптимальный результат инкубации 60-120 мин. В нашем случае технически удобнее было проводить инкубацию в течение 60 мин.

Третье отличие способа заключается в том, что обесцвечивание проводят путем создания т.н. "влажной камеры" с использованием 1 мл раствора хлорного золота (В чашках Петри, реактив накапывается s количестве 0,5-1,0 мл на срез); В прототипе этот этап проводится путем погружения предметных стекол со срезами в биологические стаканчики с реактивом (25 — 30 мл).

1835512

55 щает время окраски

Необходимость использования в предлагаемом способе именно такого порядка доказана экспериментально. В данном способе идет последовательно фиксация забранного материала, выявление нервных волокон путем импрегнации, закрепление результата импрегнации, получение контрастного препарата эа счет воздействия на остальные тканевые структуры и приготовление постоянного препарата. Изменение порядка окраски приводит как правило к полному отсутствию результата, реже — к значительному его ухудшению, Положительный эффект способа заключается в снижении токсичности за счет исключения использования пиридина, зкономии таких дорогостоящих реактивов как нитрат серебра и золотохлористоводородная кислота в25 — 30раз; упрощении способа за счет исключения применения специального стеклянного инструмента; сокращения времени импрегнации с 24 ч 10 мин до 3 ч

55 мин; возможности работы с архивным материалом.

Изобретение осуществляется следующим образом. Пример дан в виде выписки из протокола эксперимента от 27 февраля

1990 года ЬЬ 6, Импрегнировался архивный материал от 12.05,80 г, Экспериментальное животное — собака, самка, вес — 15,5 кг.

Забор материала (жизнен новажные органы) проводился после эфирно-кислородного наркоза. Материал фиксировался в 107, нейтральном формалине в течение 2 суток с последующей заливкой в парафин. С парафинового блока стенки и папиллярной мышцы миокарда на санном микротоме была сделана серия срезов толщиной 3 — 7 мкм.

Срез наклеивался на предметное стекло, подсушивался и импрегнировался. Для этого срез депарафинировался по общепринятой методике, помещался в дистиллированную воду на 2 мин, затем помещался в чашки Петри, где на срез нэкапывался

20 раствор нитрата серебра. После этого чашки Петри заклеивались лейкопластырем и помещались в термостэт для инкубации на

60-120 мин при 37 С. Затем стекло со срезом проводилось через 3 порции 1 кислого формалина до полного отхождения мути.

После чего срез помещали в чашках Петри, заклеенных лейкопластырем, в раствор аммиаката серебра, накапанный на срез, на 2 мин, Проводили через несколько порций

0,5, кислого формалина, останавливали импрегнацию в аммиачной воде. дифференцировали тканевые структуры в 2 растворе нэдсернокислого аммония, прекращали процесс дифференцировки в 7 растворе сернистокислого натрия. тщательно отмы5

50 вали в дистиллированной воде. Обесцвечивали фон среза в 0,17 растворе хлорного золота. Реактив накапывали на срез и помещали стекло в чашки Петри, заклеенные лейкопластырем. Восстанавливали серебро в

5$ растворе гипосульфита 1 мин. Тщательно отмывали срезы в дистиллированной воде по общепринятой методике, Обезвоживали и заключали в бальзам также по общепринятой методике.

На.полученном препарате при послойном описании под эпикардом видна четко просматриваемая поперечно-полосатая исчерчечность (серый фон). Хорошо видна капиллярная сеть за счет прокрашивания эритроцитов; по форме находящихся в микрососудах эритроцитов определяется просвет капилляров. Нервных волокон немного, короткие, слегка извилистые, располагаются параллельно капиллярам и кардиомиоцитам. В интрамуральном слое нервные волокна прослеживаются с трудом. очень короткие, сравнимы с диаметром эритроцитов, тонкие. Более длинные и более крупные нервные волокна кэк бы опоясывают группы мышечных волокон. Ближе к эндокэрду располагаются вдоль поперечного среза мышечных волокон. Интенсивно прокрашенные, извилистые. Под эндокэрдом: оперечно-полосатая ичерчен ность менее четкая, капиллярнэя сеть прослеживается хорошо. Эритроциты округлой формы, свободно лежащие, Нервные волокна располагаются вдоль кардиомиоцитов (см. чертеж), а также в пространстве между несколько рэзволокненными миофибриллэми и в поперечном направлении по отношению к кэрдиомиоцитэм, Предлагаемый способ был применен для исследования влияния ишемии на морфогистохимию нервных волокон миокарда.

Исследовались 32 препарата, сделанных с архивного материала.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что предлагаемый способ имеет большие преимущества и может широко использоваться в экспериментальной медицине и биологии. Может быть использован для архивногс материала, залитого в парафин.

Не-требует применения специальных стеклянных инструментов, что значительно облегчает работу лаборанта. Исключает работу с ядовитым реактивом, экономит дорогостоящие реактивы. Значительно сокрэФормула изобретения

Способ подготовки гистологического препарата для выявления нервных волокон на срезах ткани путем ее фиксации, изготовления парафиновых срезов. импрегнации

1835512

Составитель И.Скворцова

Техред М.Моргентал Корректор О.Кравцова

Редактор

Заказ 2981 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 среза 20 -ным раствором нитрата Серебра с последующим обесцвечиванием фона среза 0,1 -ным раствором хлорного золота, обезвоживанием и заключением в бальзам.. отличающийся тем, что, с целью 5 упрощения способа и сокращения времени исследования, фиксацию ткани проводят

10$-ным раствором нейтрального формалина в течение 2 сут, а импрегнацию осуществляют нанесением 20 -ного раствора нитрата серебра в виде капель на срез в количестве 0,5-1,0 мл с инкубацией при

37 С s чашках Петри в течение 60-120 мин с последующим обесцвечиванием фона среза раствором хлорного золота в количестве

0,5-1,0 мл в чашке Петри,