Способ идентификации субпопуляций лимфоцитов

 

Использование: в медицине, а именно в иммунологии. Сущность изобретения: один из фиксированных эритроцитарных реагентов предварительно окрашивают 0,1%-ным раствором одного из красителей (ализариновый желтый, амйдочерный, хризоидин, зозин натрия, эритрозин, кристаллвиолет), окрашенные эритроциты отмывают, используют вместе с неокрашенным эритроцитарным реагентом в розеткообразовании, приготовленный затем мазок фиксируют в ацетоне в течение 4,9-5,1 мин при комнатной температуре . Способ дает возможность дифференцировать лимфоциты и моноциты между собой и мононуклеары каждого, из этих типов по двум маркерам одновременно . 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4902023/14 (22) 11.01.91 (46) 30.04.93. Бюл. N. 16 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней(72) Б.В.Каральник и М.M.Þãàé (56) Цой И.Г, и др. Стабилизированный диагностикум для идентификации Т-супрессоров методом комбинированного розеткообразования. Лабораторное дело, 1987, гв 12, с..919-921. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЯИМФОЦИТОВ (57) Использование: в медйцине, а именно в иммунологии, Сущность изобретения: один

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, Идентификация лейкоцитов, особенно лимфоцитов, по их мембранным рецепторам и антигенам — одна из важнейших задач экспериментальной и клинической иммунологии.

Цель изобретения — повышение точности идентификации субпопуляций лимфоцитов.

Способ осуществляют следующим образом, Смешивают равные объемы 5-25 взвеси фиксированных эритроцитов и 0,1 ного раствора красителя. Смесь выдерживают в кипящей водяной бане в течение 60-90 мин, Окрашенные эритроциты трехкратно отмывают забуференным, рН 7,2 0,85 -ным раствором хлорида натрия, Технология это„„5U „„1812493 А1 из фиксированных эритроцитарных реагентов предварительно окрашивают

0,1%-ным раствором одного из красителей (ализариновый желтый, амидочерный, хризоидин, зозин натрия, эритрозин, кристаллвиолет), окрашенные эритроциты отмывают, используют вместе с неокрашенным эритроцитарным реагентом в розеткообразовании, приготовленный затем мазок фиксируют в ацетоне в течение 4,9 — 5,1 мин при комнатной температуре. Способ дает возможность дифференцировать лимфоциты и моноциты между собой и мононуклеары каждого из этих типов по двум маркерам одновременно. 4 табл. го этапа соответствует способу прототипа; но в качестве красителя используют один из перечисленных выше красителей. Проводят смешанное розеткообразование в обще- Э принятом режиме с применением двух зрит- фь роцитарных реагентов — неокрашенного и со предварительно окрашенного. Затем гото- (1 вят мазок, который фиксируют химически чистым ацетоном в течение 4,9-5,1 мин, при комнатной температуре (15 — 25 С). Фиксированный мазок окрашивают по Романовскому-Гимза. Окрашенный эритроцитарный реагент под микроскопом имеет фиолетовую окраску (при использовании всех перечисленных, кроме хризоидина, красителей) или желтую (при использовании хризоидина) окраску, Другой эритроцитарный реагент (неокрашенный) имеет красный цвет, а

1812493 розово-фиолетовые моноциты и лимфоциты различаются морфологически. Возможны следующие варианты маркирования розеткообразующих клеток: лимфоцит не связал оба эритроцитарных реагента (количество авязанныхлимфоцитом эритроцитов каждого из реагентов не превышает двух) — такой лимфоцит не имеет ни одного из двух определяемых маркеров; лимфоцит связал не менее трех эритроцитов неокрашенного реагента (для маркера 1) и не более двух эритроцитов окрашенного реагента (для маркера 2) — такой лимфоцит имеет маркер

1 и не имеет маркера 2; лимфоцит связал не более двух эритроцитов неокрашенного реагента и не менее трех эритроцитов окрашенного реагента — такой лимфоцит имеет маркер 2 и не имеет маркера 1; лимфоцит связал не менее трех эритроцитов каждого из двух реагентов (неокрашенного и окрашенного) — такой лимфоцит имеет оба маркера.

Сходными с прототипом признаками являются: 1. Применение для идентификации путем смешанного розеткообразования одного из предварительно окрашенных эритроцитарных реагентов.2. условия окраски эритроцитарного реагента.

Существенным отличительным признаком является применение других красителей для предварительной окраски фиксированных эритроцитов и другого способа фиксации мазка, что обеспечивает возможность визуальной дифференциации в мазке разных эритроцитарных реагентов в розетках и морфологической дифференциации лимфоцитов и моноцитов, П р и м е.р 1. Сравнение предлагаемого и известного способов. По предлагаемому способу: а) окрашивают бараньи фиксированные ацетальдегидом эритроциты амидочерным (или любым другим из перечисленных красителей) путем смешивания равных объемов 10, взвеси эритроцитов и 0,1 раствора красителя, выдерживают смесь при периодическом встряхивании в течение 60 мин в кипящей водяной бане, отмывают эритроциты забуференным (рН 7,2) 0,85$, раствором хлорида натрия (режим этого этапа — как в известном способе). б) готовят смесь эритроцитарных реагентов для розеткообразования, соединяя равные объемы взвесей окрашенный эритроцитов барана и эритроцитов быка, сенсибилизированных антителами, каждая из которых содержит 2,4 х 10 клеток в 1 мл. в) соединяют полученную смесь и взвесь выделенных лимфомононук«леаров, содержащую 2 х 10 клеток в 1 мл, в

6 равных объемах. Полученную смесь выдерживают 5 мин при 37 С, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и дополнительно инкубируют 1 ч при 4 С) готовят мазок, сушат его при комнатной температуре и фиксируют в ацетоне в течение 5 мин при комнатной температуре. д) после высушивания мазка его окрашивают по Романовскому-Гимза и под микроскопом подсчитывают содержание моно- и смешанных розеток, Опыт про10 веден при обследовании 5 доноров.

Предварительное осуществление способа точно по описанию прототипа (учет в камере Горяева) не позволило дифференцировать лимфоциты и моноциты. Поэтому

15 способ прототипа, с целью обеспечения дифференциации лимфоцитов и моноцитов, использован в варианте учета розеткообразования в мазке. На этапе а) фиксированные ацетальдегидом бараньи эритроциты окра20 шивают 0,1 -ным раствором генцианвио: лета, на этапе г) мазок фиксируют 96 метанолом. Остальные этапы выполняют— как описано выше. Способ применен при обследовании тех же 5 доноров. Получен25 ные результаты приведены в табл. 1.

Определение розеток для каждого обследуемого при применении предложенного и известного способов проводили раздельным подсчетом 7 сотен лимфоцитов.

30 По известному способу дифференциация розеток с Е бар. и EA в мазке невозможна, эти эритроциты одинаково окрашены в розовый цвет, поэтому нельзя определить, какой реагент связан. По предлагаемому

35 способу удалось, благодаря возможности четкой дифференциации Е бар. и ЕА, определить специфические моно- и смешанные (двойные) розеткообразук}щие лимфоциты.

Пример 2, Выбор красителя для

40 предварительного окрашивания эритроцитов. Фиксированные эритроциты окрашивали одним из следующих красителей: влизариновый красный, ализариновый желтый, метиловый красный, нейтральный

45 красный, кислотный хромтемнокислый, резазурин. иодэозин, аурофосфин, амидочерный, хризоидин, зозин натрия, родамин, кристаллвиолет. Все этапы выполняли — как описано в примере 1 для предлагаемого

50 способа. Результаты приведены в табл. 2.

Видно, что из использованных красителей четкое отличие окраски двух эритроцитарных реагентов — предварительно

55 окрашенного и не окрашенного обеспечивают; ализариновый желтый, амидочерный, хризоидин, зозин натрия, эритрозин, кри-. сталлвиолет.

Пример 3. Выбор способа фиксации мазка.

1812493

Фиксированные ацетальдегидом эритроциты барана окрашивали (отдельные порции) каждым из следующих красителей: ализариновый желтый, амидочерный, хризоидин, эозин натрия, эритрозин, кристаллвиолет — как описано в примере 1 для предлагаемого способа, Фиксацию мазка осуществляли одним из следующих методов: 10 раствор А9ЙОз (10 мин), 96 этанол (30 мин), смесь Никифорова (30 мин), 96 метанол (15 мин), ацетон (5 мин). Все остальные этапы выполнены— как в примере 1 для предлагаемого способа.

Результаты приведены в табл, 3. Видно, что отличие в мазке двух эритроцитарных реагентов (окрашенных и не окрашенных предварительно) обеспечивают, в зависимости от использованного для предварительной окраски красителя, разные фиксаторы. Но наиболее четкие и для большего числа красителей результаты получены при фиксации мазков ацетоном. Видно, что при фиксации мазков 96 метанолом эффективной по четкому различию цвета оказалась только предварительная окраска эритроцитов амидочерным. При фиксации мазков ацетоном столь же эффективна предварительная окраска эритроцитов любым из 6 использованных в этом примере красителей. С учетом высокой токсичности метанола и возможности более широкого выбора красителей для предварительной окраски эритроцитов при фиксации мазков ацетоном методом выбора при фиксации мазков является обработка их ацетоном, Преимуществом такой фиксации является одинаковая для большинства подобранных красителей окраска в мазке предварительно окрашенного эритроцитарного реагента.

Пример 5. Проверка специфичности адгезии окрашенных эритроцитов. Важно проверить, влияет ли предварительная окраска фиксированных ацетальдегидом эритроцитов на их адгезионную способность 8 розеткообраэовании. П роверку осуществляли, используя фиксированные ацетальдегидом эритроциты кур, практически лишенные адгезивных свойств, и такие же эритроциты барана, активно участвующие в спонтанном розеткообразовании. 5

При исследовании мононуклеаров больных оценивали влияние предварительного окрашивания этих эритроцитов кристаллвиолетом на их связывание лимфоцитами (таб. 4), Видно, что предварительная окраска 5 фиксированных эритроцитов не изменила их адгезивных свойств (не увеличила и не снизила). Следовательно, специфичность розеткообразования с окрашенными по предлагаемому способу эритроцитами сохраняется.

5 Пример 6, Выбор длительности фиксации мазка ацетоном. Предлагаемый способ осуществляли как в примере 3, при использовании красителя кристаллвиолета и различной длительности фиксации мазков

10 ацетоном — 1, 3, 5 и 10 мин. Точность регистрации экспозиции при фиксации «+5-6 с.

Получены следующие результаты. Фиксация мазков в течение 1-3 мин не обеспечивает четкой цветовой дифференциации

15 неокрашенных и предварительно окрашенных эритроцитов. Фиксация мазков в течение 10 мин приводит к разрушению некоторых мононуклеаров.

Следовательно, оптимальной длитель20 ностью фиксации мазков является 5 мин, а с учетом точности регистрации экспозиции

5,0 «-0,1 мин, Таким образом, разработан способ идентификации субпопуляций лимфоцитов

25 смешанным розеткообразованием с эритроцитарными реагентами, позволяющий использовать эритроциты, не различающиеся морфологически. Способ может быть использован для идентификации лимфоци30 тов по наличию двух различных маркеров, например, по рецептору к эритроцитам барана и Fc фрагменту IgG, или по анти генсвязывающему рецептору и рецептору к эритроцитам барана и т,п, Кро35 ме того, поскольку учет розеткообразования, выполняется в мазке, а предлагаемый способ позволяет четко дифференцировать лимфоциты и моноциты Ilo морфологии, предлагаемый способ обеспечивает диффе40 ренциацию различных розеткообразующих мононуклеаров.

Формула изобретения

Способ идентификации субпопуляций лимфоцитов путем проведения реакции ро45 зеткообразования с окрашенными и неокрашенными эритроцитами барана с последующим микроскопическим исследованием полученных препаратов, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения

0 точности способа, окраску эритроцитов осуществляют О, l -ным раствором или ализаринового желтого, или амидочерного, или хриэоидина, или эозина натрия, или эритрозина, или кристаллвиолета, а микроскопиче5 ское исследование проводят на мазке, фиксированным в ацетоне в течение 4,9-5,1 мин при 15 — 25 С.

1812493

Таблица 1

Возможности предлагаемого и известного способов.

Таблица 2

Выбор красителя. агента предварительно не окрапредварительно окрашенных шенных

Розовый

Фиолетовый

Розовый

Красный

Тот же

Красный

Коричневый

Красный.Тот же

Коричневый

Тот же

Фиолетовый

Желтый.

Фиолетовый

Тот же

Розовый

Фиолетовый

x — пригодные длл предлагаемого способа красители

Краситель для эритроцита рного реАлизариновый красный

Ализариновый желтый"

Сафранин

Метиловый красный

Нейтральный красный

Пиронин

Кислотный хромтемнокислый

Резазурин

Иодэозин

Аурофосфин

Амидочерный"

Хризоидин"

Эозин натрия".

3ритрозин"

Родамин

Кристалл виолет"

Цвет эритроцитов в фиксированном и окрашенном мазке

1812493

3З

z и

CL

I г

I» о

Ф

=3 а

Ф

О с

I

l с о

I

Щ о

CD

1З

Ф о

Я о

О.

3З

3

Ф

z и

Щ

CL

6ь

З

Щ и х

sK

X и

Щ а

Щ

CCl о

О.

1 г

I г

K х

З

З

=х

j hC .З в

CII

ID о

v о а

З

X о

E и

Ь

О. о

hC вЗ

CII о щоо

ФЗ

X и

Щ

CL

hC о

О»

ФЗ

X

Щ

О.

1 г

l г

I. о с

Щ

I» о

CD о) iK

2 о

CO о

0»

1З

CL

Ф о зЗ

X

Щ

О.

hC!

1 г

1 г

l,Щ о

1 l и

З

О. о

1З

2 о

Щ о

3З

X и

Щ

CL

hC яЗ

III

Ф

3 с о

З г с

l-» и

З

CL

Ф

CL о

Щ

X

5 о

0) X

CO о

О. о

О.

g) ю

Ц(3 х о

X )З

K 2 а 1»

Д с

K в

О. с

ClI о

K о

CL

I»

CL

Щ х и

CL х о

З х

CO х О о ц и C ф

4 * а о о с

С K

Ф а

Щ щ а

Щ о

1Ф о Ф е

g 2 ,.e а

Q Щ с 2 о Ф

9 и у 1З

З 2 a Ф о

Ф

М

CII O

З е

2 З их

K щ

= а

О х ао

«З аЗ о

Ф

2 Ф

З 3

Фа р Щ а+ х ос о щ

z Ф

Jl цр

Ф 2

CL щ о

Ф З аа с щ

1 1

t СЧ

1812493

Табл и ца4

Отсутствие влияния предварительного окрашивания фиксированных эритроцитов на их связывание лимфоцитами.

P — вероятность ошибки при сравнении окрашенных и неокрашенных эритроцитов нд — не делали.

Составитель Б. Каральник

Техред М. Моргентал Корректор Т. Вашкович

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1573 . Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5