Способ селекции популяции клеток in vivo

 

Использование: биотехнология, способы изменения наследственных признаков клеточных линий путем отбора опухолевых узлов по показателям микроядерного теста. Сущность изобретения: отбирают внутрибрюшинные опухолевые узлы с минимальными показателями микроядерного теста, полученные популяции клеток сёлекционируют. 1 ил..

COIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) (51)5 С 12 N 15/00, 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4906954/13 (22) 03.01.91 (46) 30.03,93 Бюл. М 12 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт разведения и генетики животных и

Институт цитологии АН СССР (72) В.Ю.Кравцов, А,Ф.Яковлев, Е.В,Федорова и Ю.Б.Вахтин (73) В.Ю.Кравцов, А.Ф.Яковлев, Е.В.Федорова и Ю,Б.Вахтин (56) Вахтин Ю.Б. Генетическая теория клеточных популяций, Л.: Наука, 1980, 166 с.

Копнин Б.П. Генетика, 1981, 18„с.308-317.

Кравцов В.Ю. Гуксова И.В., Калинская .E.Â., Швинских Н.H., Вахтин Ю.Б. Генетика, 1990, 26, с. 1584-1590.

Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к способам изменения наследственных признаков клеточных линий.

Целью изобретения является снижение кариотипической нестабильности популяций клеток миелом.

Сущность известного способа, взятого в качестве прототипа. заключается в следующем: путем внутривенной инъекции получают легочные экспериментальные метастазы уницеллюлярного происхождения рабдомиосаркамы крыс; полученные метастазы анализируют микроядерным тестом (МЯТ), отбирают один экспериментальный метастаз с максимальной частотой клеток с микроядрами, получают из него суспензию для внутривенного введения с целью реклонирования. Выросшие экспериментальные метастазы-потомки подвергаются выше описанной процедуре, т.е. оценке МЯТ, отбору одного клона с максимальным показаЯЛ,, 1806195 АЗ (54) СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ ПОПУЛЯЦИИ

КЛЕТОК lN VIVO (57) Использование: биотехнология, способы изменения наследственных признаков клеточных линий путем отбора опухолевых узлов по показателям микроядерного теста.

Сущность изобретения: отбирают внутрибрюшинные опухолевые узлы с минимальными показателями микроядерного теста, полученные популяции клеток селекционируют. 1 ил. телем МЯТ, получению из него суспензии для последующего внутривенного введения с целью реклонирования. Таким образом, отбор идет по одному экспериментальному метастазу на фоне реклонирования.

Известный способ-прототип применяется с целью изучения. корреляции между степенью нестабильности кариотипа злокачественности популяций опухолевых клеток.

В результате. применения известного способа селекции на повышение частоты спонтанного образования микроядер в клонах экспериментальных легочных метастазов перевивной рабдомиосаркомы крыс удалось получить популяцию клеток с достаточно большей частотой клеток с микроядрами и достоверно меньшим метастатическим потенциалом (степенью злокачественности).

Установлена отрицательная зависимость между степенью нестабильности кариотипа

1806195 и степенью злокачественности в популяциях опухолевых клеток.

Известно, что в ходе опухолевой прогрессии степень нестабильности кариотипа клеток возрастает, а также сохраняется на высоком уровне при пассировании опухолевых клеток линий in vivo u ln vItro.

В литературе не известны работы по проведению искусственного отбора, направленного на снижение частоты спонтанных нарушений кариотипов в популяциях перевивных клеточных линий.

Целью изобретения является снижение степени кариотипической нестабильности популяций перевивных клеточных линий миелом мышей, т.е. получение популяций клеток миелом с относительно стабильным кариотипом и, следовательно, со стабильным фенотипом, используемых .в дальнейшем для получения гибридов-продуцентов.

- Известно, что при использовании в гибридомной технологии миелом, не,тестированный на стабильность кариотипа, наблюдается высокая степень.кариотипической нестабильности и низкая эффективность секреции. гибридом. Вследствие нестабильности, несбалансированности кариотипа, элиминация хромосом с желаемыми генами может проходить с высокой частотой.

Одной из причин кариотипической нестабильности гибридов-продуцентов является изначальная кариотипическая нестабильность клеток перевивных линий, взятых в качестве партнеров для гибридизации.

В связи с этим существует необходимость получения клеточных популяций миелом с пониженной частотой спонтанной кариотипической изменчивости.

По причине наследственной гетерогенности в популяциях клеток перевивных линий по признаку "спонтанная частота клеток с МЯТ" авторы предлагают проводить искусственный отбор, направленный на снижение спонтанной частоты клеток с микроядрами. В ходе отбора установлено достоверное снижение частоты спонтанного образования микроядер в клетках, что является показателем снижения степени кариотипической изменчивости в популяциях клеток миелом.

Сущность заявленного способа заключается в том, что мышам линии BALB/ñ инъецируют внутрибрюшинную суспенэию клеток миеломы, получают внутрибрюшинные (в/б) опухолевые узлы, анализируют их методом МЯТ, отбирают в/б узлы с минимальными показателями MAT; получают иэ них суспенэию для очередного цикла отбора.

10

В качестве опухоленосителей при селекции заявленным способом могут испсльзоваться мыши других линий:

Критерием способа является спонтанная частота возникновения клеток с микроядрами. Но при селекции по высокой спонтанной частоте возникновения клеток с микроядрами (в способе-прототипе) — повышается степень злокачественности клеток и степень кариотипической нестабильности., При селекции на снижение частоты возникновения клеток с микроядрами (заявленным способом) в результате 4-х циклов отбора получают популяции клеток миело"5 мы о достоверно высокой стабильностью . кариотипа (до 0,60 Д изменчивости кариотипа), т.е. получают клетки иного качества, обладающие стабильными фенотипическими свойствами, представляющие большой ин20 терес для гибридомной технологии.

Отличительными признаками заявленного решения являются следующие признаки: внутрибрюшинная инъекция мышей ли25 нии BALB/ с суспенэией клеток миеломы.

Линия BALB/с является сингенной линией для получения конкретной миеломы SP 2/О, которая используется для получения гибридом;

30 оценка и отбор внутрибрюшинных опухолевых узлов с минимальными показателями микроядерного теста для последующего реклонирования; получение суспензии из отобранных уз35 лов для очередного цикла отбора.

Существенным признаком является отбор внутрибрюшинных узлов с минимальными показателями микроядерного теста. В результате 4-х циклов отбора по этому кри40 терию получают потомство популяции клеток миеломы, имеющее достоверно низкую частоту клеток с микроядрами (до 0,60% в среднем по популяции). В исходной же популяции средняя частота клеток с микроядрами составляет 2,1 / (с изменчивостью от

0.6 до 5,3%).

Преимуществом отбора внутрибрюшинных узлов передлегочными метастазами заключается в следующем: в их высокой

50 скорости формирования (7-14 суток) и достаточном количестве для проведения популяционного теста и отбора.

Легочные метастазы формируются в течение 30 дней и более, и количество их зна55 чительно и недостаточно для проведения селекции.

Кроме того, при отборе внутрибрюшинных узлов после нескольких циклов отбора получают популяции клеток миеломы с достоверно стабильным кариотипом и, следо1806195

На чертеже йоказана частота клеток с микроядрами (ЧКМ) во внутрибрюшинных узлах перевивной миеломы SP 2/О.

По оси абсцисс — частота клеток с микроядрами (ЧКМ), %. По оси ординат — число внутрибрюшинных узлов, %, а — 40 в/б узлов до отбора; б — 20 в/б узлов после 1-ro цикла отбора: в — 26.в/б узлов после 2-ro цикла отбора; r — 33 в/б узла после 3 цикла отбора; д — 25 в/б узлов после 4 цикла отбора, направленного на снижение спонтанной

ЧКМ в в/б узлах.

55 вательно, стабильными фенотипическими признаками, обеспечивающими высокую жизнеспособность клеток, и при использовании их для получения гибридом — стабильную секрецию антител, 5

Таким образом, в результате селекции по признаку низкой спонтанной частоты возникновения клеток с микроядрами в каждом последующем поколении популяции клеток миеломы. происходит снижение 10 степени спонтанной частоты возникновения клеток с микроядрами, т.е. снижение степени кариотипической нестабильности и степени элокачественности клеток. Селекция клеток заявленным способом позволяет 15 снизить частоту встречаемости клеток с микроядрами в 3 и более раз, что свидетельствует о повышении жизнеспособности клеток и о высокой стабильности их кариотипа, что является целью изобретения. 20

Известным же способом изучается и определяется степень злокачественности и связь ее с нестабильностью кариотипа в получаемых популяциях клеток, не представляющих интереса для гибридомной би- 25 отехнологии из-эа их нестабильных фенотипических свойств, обусловленных нестабильностью кариотипа, B способе-прототипе проводится отбор одного метастаза с максимальной частотой 30 клеток с микроядрами и в результате нескольких циклов отбора установлено возрастание степени нестабильности кариотипа и степени элокачественности клеток, т.е. обеспечивается получение популяции кле- 35 ток с высокой спонтанной частотой возникновения микроядер.

Использование отселектированных заявляемым способом на стабильность кариотипа клеток миелом при получении 40 гибридом повысит уровень селекции гиб. ридом, что даст в итоге экономию в народном хозяйстве, Предлагаемый способ может применяться на предприятиях биотехнологической, меди- 45 цинской промышленности и в научно-исследовательских целях, Пример. Отбор s/б узлов миеломы

SP 2/О проводили по следующей схеме. Вычлененные из брюшной полости декапитированной мыши 40 в/б узлов (в/б узлы фиксированы на кишечнике и брызжейке) отдельно помещают в лунки иммунологического планшета (ТУ 64-2-279-79) со средой

199.

Узелки достают иэ лунки и методом отпечатков делают мазки на стерильном предметном стекле (около 1000 клеток на 1 предметное стекло), пронумерованном соответственно номеру лунки.

Оставшуюся часть в/б узлов помещают обратно в лунку, планшет закрывают и помещают в холодильник при +4 С на 8-12 ч, Приготовленные мазки фиксируют 96% этиловым спиртом с течение 5 мин, высушивают. окрашивают азур-зозином (в соотношении 1 часть 0,1% зоэина на 3 части

0,1 аэура,,разбавленного в 50 раз дистиллированной водой) в течение 10 мин.

Затем проводят микроядерный тест под иммерсией (окуляр 10, объектив 100). В каждом мазке методом МЯТ анализируют по

300 клеток, Частоту клеток с микроядрами выражают в процентах. Средняя частота клеток с микроядрами (ЧМК) в исходной выборке из 40 в/б узлов составила 2,1, размах изменчивости от 0,6% до 5,3% (чертеж).

Из исходной популяции отбирают узлы с минимальными показателями МЯТ, имеющие от 0,6 до 1,0% клеток с микроядрами.

Из них готовят суспензию для в/б инъецирования, для чего их помещают в стерильные флаконы (бак-печатки), гомогенизируют с помощью ножниц, заливают 5 мл универсальной среды ТС-199 и пипетируют шприцем в течение 3 мин.

Полученную суспензию фильтруют «ерез 4 слоя стерильной марли в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение

5 мин при 1000 об/мин. Надосадок сливают.

К полученному осадку клеток добавляют 3 мл среды ТС-199, определяют концентрацию клеток с помощью камеры Горячева и доводят концентрацию до 3 млн. клеток/мл, Подготовленную таким образом суспензию клеток миеломы инъецируют внутрибрюшинно мышам линии BALB/с в дозе 1 мл/особь.

Через 12 суток появляются признаки внутрибрюшинного асцитного роста (видиМое увеличение области живота животного).

Вскрывают брюшную полость, отпрепаровывают сформировавшиеся опухолевые узлы, помещают их в лунки иммунологического планшета со средой ТС-199, делают мазки, проводят оценку методом МЯТ, анализируя по 300 клеток каждого иэ 20 иссле1806195 дуемых в этом цикле в/б узлов, определяют частоту клеток с микроядрами. Средняя частота клеток с микроядрами в результате

1-го цикла отбора составила 1,1 (чертеж).

Отбирают 5 узлов с минимальными показа- 5 телями МЯТ, имеющих от 0 3-0,6 клеток с микроядрами и используют их для очередных в/б прививок во 2-ой цикл отбора.

Таким образом, описанные выше манипуляции повторяются на каждом цикле отбора. 10

В результате двух циклов отбора средняя.частота клеток с микроядрами понизилась до 0,89 („а размах изменчивости сузился (min — 0;(„max — 3 ) (чертеж). Пять из 26 исследованных в/б узлов с минималь- 15 ными показателями МЛТ (от 0 до 0,3 ) были отобраны для 3-го цикла отбора.

В результате 3 цикла отбора, проведенного методом, описанным выше, средняя частота клеток с микроядрами в популяции 20

33 в/б узлов составила 0,75 j, (чертеж). В очередной, четвертый цикл отбора были взяты в/б узлы, имеющие 07 клеток с микроядрами.

Четвертый цикл отбора также оказался 25 эффективным: средняя частота клеток с микроядрами в выборке иэ 25 в/б узлов составила всего 0,60 Д, 56 Д в/б узлов имели показатели микроядерного теста не более 1 (чертеж).

Таким образом проведены 4 цикла искусственной селекции популяций клеток миелом на снижение степени частоты клеток с микроядрами (кариотипической изменчивости). Частота встречаемости клеток с микроядрами в полученных путем заявляемого . способа селекции популяциях клеток миелом снизилась с 2,1 до 0,60;, те. в 3 с лишним раза (при Р < 0,001 по непараметрическому критерию Вилкоксона-МаннаУитин).

Формула изобретения

Способ селекции популяции клеток in

volvo, включающий экспресс-анализ частоты микроядер в опухолевых узлах, отбор опухолевых узлов с их дальнейшей перевивкой, отличающийся тем, что, с целью снижения степени кариотипической нестабильности популяции клеток миелом, отбирают внутрибрюшинные опухолевые узлы с минимальными показателями микроядерного теста.

1806195

«у /у) fD

4+/Г) /р

«ж«уф ю /у

Редактор 3. Ходакова

Заказ 966 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 с

/а

Яр

4

l

Составитель 8. Кравцов

Техред М.Моргентал КоРРектоР 3. Салка