Способ получения монокло- нального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцита человека, культивируемая клетка гибридомы jthfs-про- дуцентмоноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцита чело- века, культивируемая клетка гибридомы jti-if3-f5 - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцитачеловека, культивируемая клетка гибридомы jti-id7 - про- дуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцита человека, культивируемая клетка гибридомы jt2- n15 - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцитачеловека
Использование: иммунология, биотехнология , медицина. Получены моноклональные анти-моноклонально-анти-человеческо-Т4-ли мфоцитные антитела, вырабатываемые новыми линиями клеток гибридом мышей JTI-IF 3, JTI-IF 3-Е5, JTI-ID 7 и JT2-N15. Линии клеток гибридом получены путем слияния NSI/1 клетки миемомы мыши и клетки селезенки мыши, иммунизированной ОКТ4А (моноклональное анти-человеческо-лимфоцито-Т4-антитело) с помощью полиэтиленгликоля. Линия клеток JTI-IF3 депонирована под номером ЕСАСС 87062501, JTI-IF3-E5 - под номером ЕСАСС 87062502, JTI-ID7 - под номером FERM BP-1685, JT2-N15 - под номером FERM ВР-1684. Моноклональные антитела способны нейтрализовать in vitro ВИДЧ - варианты. 3 табл. Se Ё 00 о
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 5/00. 15/00
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ъ (; ь:, в ф „, p
91 . "ЕЛ:1О „.. ""
К ПАТЕНТУ (21) 4355471/13 (22) 18.02,88 (46) 07,03,93. Бюл, ¹ 9 (31) 016282; 064066; 146371 (32) 19,02,87; 29.06,87; 03.02.88 (33) US (71) Ниссин Сокухин Кабусики Кайся (JP) (72) Цунея Охно (J P) (56) BiO/Technology v.5, 1987, р. 421 — 422. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К МОНОКЛОНАЛЬНОМУ АНТИТЕЛУ К БЕЛ КУ Т4
ЛИМФОЦИТА ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕMAR КЛЕТКА ГИБРИДОМЫ ЛТНРЗ вЂ” ПРО ДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО
АНТИТЕЛА К МОНОКЛОНАЛЬНОМУ АНТИТЕЛУ К БЕЛКУ Т4 ЛИМФОЦИТА ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕМАЯ КЛЕТКА
Г И Б Р И ДО М Ы J T I- I FÇ- F5 — П Р ОДУ Ц Е Н Т
МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К МОНОКЛОНАЛЬНОМУ АНТИТЕЛУ К БЕЛКУ Т4
ЛИМФОЦИТА ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕМАЯ КЛЕТКА ГИБРИДОМЫ ЛТН07 — ПРОДУЦЕ НТ МОН ОКЛОНАЛ Ь НОГО
Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для диагностики и лечения инфекций, вызываемых вирусом иммунодефицита человека.
Существует потребность в разработке нрвых методов для диагностики присутствия ВИДЧ-частиц и ВИДЧ-инфицированных клеток в образцах биологических жидкостей и тканей. Значительной способностью к нейтрализации in vitro ВИДЧ-инфекционноАНТИТЕЛА К МОНОКЛОНАЛЬНОМУ АНТИТЕЛУ К БЕЛКУ Т4 ЛИМФОЦИТА ЧЕЛОBE КА, КУЛ ЬТИВИ РУЕ МАЯ КЛ ЕТКА
ГИБРИДОМЫ JT2-N15 — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К МОНОКЛОНАЛЬНОМУ АНТИТЕЛУ К БЕЛКУ Т4
ЛИМФОЦИТА ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: иммунология. биотехнология, медицина. Получены моноклональные анти-моноклонально-анти-человеческо-Т4-ли мфоцитные антитела, вырабатываемые новыми линиями клеток гибридом мышей .1ТНР 3, .3ТНР 3-Е5..3ТНО 7 и JT2-N15. Линии клеток гибридом получены путем слияния NSI/1 клетки миемомы мыши и клетки селезенки мыши, иммунизированной ОКТ4А (моноклональное анти-человеческо-лимфоцито-Т4-антитело) с помощью полиэтиленгликоля.
Линия клетокЗТНРЗдепонирована подномером ЕСАСС 87062501, JTI- РЗ-Е5 — под номером ЕСАСС 87062502, ЛТН07 — под номером
FERM BP-1685, JT2-N15 — под номером
FERM ВР-1684. Моноклональные антитела
/ способны нейтрализовать in vitro ВИДЧ— варианты. 3 табл. сти множества штаммов ВИДЧ обладают моноклональные анти-ОКТ4А-антитела.
Настоящее изобретение описывает способ получения моноклонального антитела к моноклональному антителу против белка Т4 лимфоцита человека (ОКТ4-А) и используемые при этом новые линии гибридомных клеток мышей. Новые линии гибридомных клеток мышиного происхождения обозначены 1ТНРЗ (депонирована ЕАСС 87062501
1801117
25.06,87), ЛТНРЗ-Е5 (депонировала ЕСАСС
87062502 25.06.87), 1 Т Н 07 (Р Е ЯМ B P-1685
29.01.88), JT2-N15(депонирована РЕЯМ ВР1684 29,01.88)../ТНРЗ-Е5 и ЛТН07 получают путем субклонирования )ТНРЗ, 5
Линии гибридомных клеток имеют следующую характеристику: х) JT2-N15 — продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека. 10
1), Родословная: а) родительские клетки гибридом: NS!/l клетки миеломы мыши и клетки селезенки мыши; б) антиген: антитело ОКТ4А; 15 в) сливающий агент; полиэтиленгликоль (ПЭГ) 1500;
r) процент позитивных клонов; 65 ф,.
2), Стандартные условия выращивания: . а) состав питательной среды:
RM1 1640/GIBCO/, 15 -ная инактивированная лошадиная сыворотка, 2 мМ вЂ” глутамин, 1 мМ L пируват натрия, 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина; б) температура 37 С; 25 в) рН питательной среды: 7,4; г) прочее: 5 С02, 95 д воздуха, 100 влажности, 1х10 клеток/на пробирку, 3) Кул ьтурал ьн ые свойства: а) способ культивирования: методы кле- 30 точных культур Manmalian; б) посевная доза: следует поддерживать
1х10 кл./мл; в) кратность рассева: 15-20 х, r) время субклонирования: до того, как количество клеток не превысит 1х10
2х10 /мл.
4) Характеристика культивирования гибридом в организме животных: а) вид животного: ВА LB/с мышь, Старше 5 недель; б) доза клеток при прививке: 2х10 гибридных клеток.
e) метод сенсибилизации животного: инъекция 0,5 мл Pristane за 2 — 4 недели до 45 прививки гибридных клеток; г) время образования асцита или забора сыворотки: 2 — 3 недели после прививки клеток; д) прививаемость: хорошо вызывает у мыши асцит; ж) данные по видовой принадлежности: мышь, BAL В/с; з) Контроль контаминации: добавление антибиотиков в культуральную среду. 55
5. Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом; а) группа иммуноглобулинов IgGI б) специфичность продуцируемых иммуноглобулинов и методы оценки продуцируемых иммуноглобулинов: анализируют реакционную способность по отношению к антигену (ОКТ4А) с помощью методики FLiS
А s s а у / Н î r e s с е и с е — L i n k e d
Immunosorbent — флуоресцентная методика, включающая использование иммуносорбента.
6). Характеристика биосинтеза полезных продуктов in vitro; а) выход антител: in vitro 1 мкгlмл; б) уровень активности: 2000 ITC/10 мкг/мл; в) титр антител: 1000 х
7). Способ криоконсервации; а) температура хранения 198 С; б) среда: R PM 1640 (GIBCO), 15 лошадиная сыворотка; в) криопротектор: 10 ДМЯО (диметилсульфоксид); г) условия замораживания и отогрева: замораживание: -20 С в течение 2 ч, -80 С в течение 1 дня, затем перенести пробирки в жидкий азот, Отогрев; вытащить пробирку. Затем быстро на водяную баню при 37 С до превращения в жидкость. Взять клетки пипеткой
Пастера и перенести их в 50 мл холодной среды и промыть; д) жизнеспособность гибридных клеток после криоконсервации; после одного месяца более чем 807, клеток остаются живыми; е) метод оценки жизнеспособности:
Trypam blue Staing (окрашивание Trypam
blue), Следующие примеры иллюстрируют изобретение.
Пример 1. Мышей линии BALB/с в возрасте 5 — 6 недель иммунизируют антигеном
ОКТ4А (коммерческий препарат моноклонального анти-человеческо-лимфоцито-Т4-антитела) в дозе 15 мкм очищенного препарата на мышь с помощью иглы, которую вводят в селезенку через разрез на коже брюшка. Вторую иммунизацию поводят через 7 дней после первой путем введения 10 мкг препарата, третью иммунизацию проводят через 13 дней, вводя
5 мкг антитела в селезенку.
Спустя 4 суток после последней бустерной инъекции мышей забивают и в асептических условиях извлекают селезенки и их помещают на чашки Петри (на льду), содержащие модифицированную по Дульбекко среду Игла. Селезенки очищают от жира и соединительной ткани, пропускают через сетку из нержавеющей стали калибра 100.
Результирующие индивидуальные клетки селезенки центрифугируют 10 мин при 1000 об./мин с образованием осадка. Клеточный осадок дважды промывают средами (аналогично описанному выше) и повторно суспен1801117
55 дируют в RPM 1640 и концентрацию клеток оп ределяют подсчетом на гемоцитометре в присутствии 0,2/ трипан-синего, Клетки миеломы мышей NS1/1 Ag 4.1, полученные на расе Balb/с, выращивают в среде RPM1 1640, содержащей 15 инактивированной тепловой обработкой сыворотки лошади ("Пел-Фриз" ). Клетки центрифугируют 10 мин при 1000 об./мин с образованием осадка и промывают средой
КФМ1 1640, не содержащей антибиотика.
Концентрацию клеток определяют подсчето а после повторного суспендирования в то же среде.
Клетки селезенки и NS1/1 комбинируют в соотношении 4:1 и центрифугируют 10 мин при 1000 об./мин . Надосадочную жидкость отсасывают и слияние клеток проводят при 37 С с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) 1500, мол.м. 500—
600. Процедуру проводят при постоянном осторожном перемешивании и добавлении следующего: 1 мл 50% ПЭГ в RPM1 1640, содержащем 15% лошадиную сыворотку, в течение минуты; 1 мл RPM1 1640, содержащего 15% лошадиную сыворотку, в течение минуты; 1 мл RPM1 1640, содержащего 15% лошадиную сыворотку, добавляемого в течение 1 мин; 8 мкл RPM1 1640, содержащего
15% лошадиной сыворотки, добавляемого в течение 2 мин.
Результирующие клетки слияния цент, рифугируют 10 мин при 1000 об./мин, повторно суспендируют в RPM1 1640, содержащей 15% лошадиной сыворотки и пенициллин-G и стрептомицин в количестве
100 ед. и 100 мг на 1 мл соответственно.
Клетки помещают в чашки в количестве 0,1 мл на ячейку в 96-ячеечных чашках, предварительно уравновешенных в 5% COz, Чашки инкубируют в течение ночи при 37 С в 5
СО2.
На вторые сутки в каждую ячейку вводят
0,1 мл среды HAT (13,6 мкг/мл гипоксантина, 0,176 мкг/мл аминоптерина и 3,88 мкг/мл тимидина) в RPM1 1640, содержащем 15% лошадиную сыворотку. Эта среда обеспечивает избирательное выживание гибридов клеток сыворотки NC1/1, что создает условия для скрининга неслитых клеток NC1/1 или слитых с другими клетками, Неслитые первичные клетки селезенки взрослых мышей не выживают в культуре дольше нескольких суток.
На 3, 4, 6, 9 и 12 сутки из каждой ячейки отводят 0,1 мл среды и добавляют 0,1 мл свежей HAT в RPM1 1640, содержащей 15 лошадиной сыворотки. На 15, 19, 23 и 27 сутки из каждой ячейки отводят 0,1 мл среды и заменяют с помощью 0,1 мл среды
20 25
RPM1 1640, содержащей 15 лошадиную сыворотку и только гипоксантин и тимидин в указанной выше концентрации. На 28 сутки культуральные надосадочные жидкости из всех ячеек подвергают скринингу для выявления антитела, специфичного в отношении ОКТ4А.
Для выявления гибридом, продуцирующих антитела на ОКТ4А используют метод флуоресцентно-связанного иммуносорбентного анализа ("FLISA"). Отобран положительный клон JTI-IFÇ. Антитела надосадочной жидкости проявляют реактивность по методу анализа пятен по Уастерну с ВИДЧ-белком молекулярной массы
60000 — 80000. Антитело клона ЛТНЕЗ относится к изотипу IgG.
Пример 2, ВИДЧ-нейтрализация.
Надосадочные жидкости гибридомных культур проверяют на способность к нейтрализации ВИДЧ следующим образом, Надосадочные жидкости трехсуточного роста разбавля ют 1:5 в пол ной среде (500 мл RP М1
1640; 6 мл 100 х пенициллин(стрептомицин;
6 мл 100 x -глютамин, 100 мл FCS; и 1,2 мл
Polybrene Stock (1 мг/мл)). 200 мкл разбавленной средой пробырбавляют во все ячейки 24-ячеечной микротитровальной чашки, за исключением двух, а в две ячейки вводят равное количество одной лишь среды. Дополнительную среду добавляют к одной из ячеек "с одной лишь средой" и в каждую оставшуюся ячейку вводят 200 мкл высокотитрового ВИДЧ-вирусного материала.
Чашки запаивают в пластиковые мешки, инкубируют 1 — 1,5 ч при 4 С и оставляют доходить до 17 С при стоянии в течение 15 мин.
Клетки Н9 инкубируют в полной среде в течение 30 мин при 37 С при плотности
1х10 кл./мл, затем центрифугируют и по6 вторно суспендируют в свежей полной среде при плотности 5х10 кл./мл. 200 мкл клеточной суспензии добавляют к каждой ячейке (доводят общий объем до 600 мкл) и чашки инкубируют 1 ч при 37 С. после чего
150 мкл переносят на дублирующую чашку, содержащую 2 мл свежей полной среды на ячейку, Культуры инкубируют при 37 С в
COz-инкубаторе, Спустя 4 суток культуры делят и добавляют свежую полную среду.
На 7 сутки инкубирования готовят пробы для нейтрализационного скрининга по методикам IFA и обратной транскриптаэы (RT) В табл.1 приведены результаты in vitro — нейтрализирующей активности для антитела ЛТНЕЗ относительно 3-х испытанных вариантов ВИДЧ (ВИДЧ вЂ” вариант HTLV—
И!В, гаитянского ВИДЧ-варианта, обозначенного AL12112C, и африканского
ВИДЧ-варианта, 906). Антитело.1ТНЕЗ рас1801117
55 познается как общий зпитоп всех трех
ВИДЧ-вариантов. Данные нейтрализационного анализа ЛТНРЗ, ЛТНРЗ вЂ” E5, JTI-ID7 приведены в табл.2.
Пример 3, Процедуры формирования 5 и скрининга гибридом согласно примерам 1 ,и 3 вновь повторяют с использованием
ОКТ4А при следующих модификациях процедуры иммунизации. Начальная иммунизация включала внутрибрюшинную 10 инъекцию 10 мкг Monos — очищенного антитела QKT4A, вторая внутрибрюшинная инъекция (7 мкг) делалась спустя 17 суток, а последняя (7 мкг внутривенная доза) вводилась спустя 18 суток. После слияния и скри- 15 нинга для дальнейшего исследования был выбран IgGp-продуцирующий положительный клон, обозначенный JT2-N15. Подобно
ЛТНЕЗ и его субклонам JTI-IF 3-Е5 и./ТН07, клон JT2-N15 продуцировал моноклональ- 20 ное антитело, которое по данным анализа пятен по Уэстерну было реакционноспособным с ВИДЧ-белком молекулярной массой около 65 — 67.000. Культуральные среды выращивания JT2 N-15 были положительными 25 по данным анализа ELISA и результаты предварительного нейтрализационного анализа относительно НИ-IIIВ-инфективности приведены ниже в табл,3, В дальнейших процедурах скрининга 30 по нейтрализационной активности антиидиотипных антител, размноженных асцитическим методом, предварительно было установлено, что нижеследующая методика дает наиболее активный асцитический пре- 35 парат. Мышам возраста 5 — 8 недель делают
"затравку" введением 0,5 — 1 мл пристана, а спустя две недели делают инъекцию 2—
Зх10 (предпочтительно 5х106) гибридомных клеток. Сбор асцитических жидкостей 40 начинают, спустя две недели после инокулирования и собранные в самом начале жидкости (около 3-5 мл) проявляют наивысшую нейтрализационную активность. Второй сбор асцитической жидкости проводят спу- 45 стя трое суток, что дает 8 — 10 мл жидкости меньшей активности, Третий сбор у выживших животных в общем дает 3 — 5 мл жидкости, которая по большей части существенно менее активна, чем любой из материалов 50 после первого и второго сбора, Нейтрализационные данные, представленные для JTIIF3 в табл.1 и 2, основаны на асцитических жидкостях, объединенных после трех сборов, тогда как данные для JTI-! FÇ-Е5, JTI-107 и JT2-N15 в табл.2 и 3 основаны на асцитических материалах, объединенных только из первого и второго сборов.
Формула изобретения
1. Способ получения моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека, включающий иммунизацию животного антигеном, получение линии гибридомных клеток путем слияния клеток селезенки и клеток миеломы мыши, отбор линии гибридомных клеток, продуцирующих специфическое моноклональное антитело, отличающийся тем, что антиген представляет собой ОКТ4А-моноклональное антитело, способное к специфическому связыванию с СД4 белком Т4 лимфоцита человека, а линию гибридомных клеток выбирают из группы, включающей; культивируемую клетку ги6 ридом ы (Л ТН ГЗ
ЕСАСС 8706501), или культивируемую клетку гибридомы .1ТНРЗ-Е5 (6CACC 87062502). или культивируемую клетку гибридомы JTIID7 (FЕRM ВP-1685), или культивируемую клетку гибридомы JT2-N15 (FERM BP-1684).
2. Культивируемая клетка гибридомы
ЭТНРЗ (БСАСС 87062501) — продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.
3. Культивируемая клетка гибридомы
ЛТНРЗ-Е5 (ЕСАСС 87062502) — продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.
4, Культивируемая клетка гибридомы .1ТН07 (FERM BP-1685) — продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека. .5. Культивируемая клетка гибридомы
JT2-N15 (FERM BP-1684) — продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.
Приоритет по пунктам и признакам:
19,02,87 по п.1 кроме клеточных линий;
29,06.87 по пп.2 и 3:
03.02.88 по пп.4. 5.
1801117
JTI — IF3 — нейтрализация
ВИ Ч =906
ВИ Ч =А L 1212С
ВИ Ч =HT LV-111В
Син цитийиндукция
Син цитийиндукция.
Синцитий- RT активиндукция ность/ % нейт ализ.
Неинфицир. Н9
5100/
135150
ВИДЧ
ВИДЧ +
1мгlмл АЬ
56970/90,9
5730/1
+ 497850/20, 78330/
431670/31, 50700/
647670/О
132780
765000/О
16800
5460/
688680/О
ВИДЧ +
ЗООмг/мл
ВИДЧ +
600мг/мл
АЬ
ВИДЧ +
50мг/мл
АЬ
ВИДЧ + асциты (контроля) ВИДЧ + человеческая сыворотка
RT активность/ % нейт ализ.
Таблица 1
RT активность/ % нейт элиз, 4800/627510/О
Таблица 2
1801117
Продолжение табл. 2
Нейт ализация
ВИ Ч = НТ1 Н-IIIB ВИ Ч = А 1 1212С
ВИ Ч =906
RT активность/ ф, нейт ализации
RT активность/ / нейт ализации
RT активность/ 7, нейт ализации
126/О
121/Неинфиц, Н9
10990/О
33501/О
ВИДЧ
ВИДЧ + 2,9 мг/мл
NTx
9281/72,6
ВИДЧ + 1,9 мгlмл
NT
5 ВИДЧ + 1 мгlмл Ab
552/96,1
ВИДЧ + 500 мг/мл
775/94,0
NT,3ТНД7
214/О
Неинфиц. Н9
10998/О
ВИДЧ
177/100
1549/87,6 х/NT = не проверялось
Таблица 3
Составитель Г,Борискина
Техред М.Моргентал Корректор Л.Пилипенко
Редактор
Заказ 1185 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
J TI — 1РЗ
-Е5
ВИДЧ + 500 мгlмл
АЬ
ВИДЧ + 250 мг/мл
11559/65,7
17967/46,5
126/16213/О
