Способ определения концентрации лактогенных рецепторов

 

Использование биология, исследование компонентов молочных продуктов посредством рецепторного анализа с использованием меченых гормонов Сущность изобретения: из проб молока коров выделяют мембраны жировых глобул Рецепторный анализ проводят в присутствии меченого I ч и немеченого пролактина Последний используют в концентрации 0,84 120 нМ, инкубируют в буфере с рН 4,5-5,0 Центрифугируют полученную смесь измеряют зна чение радиоактивности полученного осадка Устанавливают количество связанного меченого прол актина и по нему опре деляют концентрацию лактогенных рецепторов. 2 ил. 3 табл

COlO3 СОВЕ1СКИХ сОциАлисти IFских

РЕСПУБЛИК сп)л G 01 N 33/04

1А1 os ) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4834285/13 (22) 01.06.90 (46) 30,07,92.Бюл, N 28 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт разведения и генетики сельскохозяйственных животных (72) В,А.Федосимов и М,M,Ëaðèía (53) 637.127.6 (088.8) (56) Karmer G,W, et. al., l of Endocrinolory

1986, № 109, р. 175 — 180.

"Prolacfin Receptor Content of Rabbit

Milk" M.1. Waters, Endocrinology ¹ 1980, ¹107,,NЗ,,р, 816-821, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛАКТОГЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Изобретение относится к биологии — к способам исследования и анализа материалов путем определения их физико-химических свойств, в частности к способам исследования компонентов молочных продуктов посредством рецепторного анализатора с использованием меченых гормонов, Известен способ определения концентрации лактогенн х рецепторов, При этом способе рецепторный материал получают путем взятия ткани молочной железы у коров, .

Недостатком этого способа является ограниченность количества рецепторного материала, трудоемкость его выделения и хирургическое вмешательство при взятии ткани молочной железы, приводящее к ее

Травмированию.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения содержания лактогенных рецепторов.. SU,, 1751665 А1 (57) Использование: биология, исследование компонентов молочных продуктов посредством рецепторного анализа с использованием меченых гормонов. Сущность изобретения: из проб молока коров выделяют мембраны жировых глобул. Рецепторный анализ проводят в присутствии меченого

1 и немеченого пролактина: Последний

t25 используют в концентрации 0,84--120 нМ, инкубируют в буфере с рН 4,5-5,0. Центрифугируют полученную смесь. измеряют значение радиоактивности полученного осадка. Устанавливают количество связанного меченого пролактина и йо нему определяют концентрацию лактогенных, рецепторов, 2 ил. 3 табл.

Суть способа-прототипа заключается в том, что мембраны жировых шариков выделяют из молока кроликов и подвергают рецепторному анализу путем добавления меченого и немеченого пролактина.

25.

Смесь помещают в инкубационный буфер с рН 7,4 — 7,5 и выдерживают в течение 24 ч, затем мембраны отделяют от буфера центрифугированием. Количество связанного меченого пролактина определяют по радиоактивности осадка, концентрацию рецептора определяют по графику Скзтчарда.

Недостатком прототипа является условие связывания пролактина с мембранами жировых шариков, а ййенйо йрименение инкубационного буфера с рН 7.4-7.5, при котором невозможйо определить содержание лактогенных рецепторов на мембранах жировых шариков молока коров.

Цель изобретения — повышение точности способа.

1751665

Указанная цель достигается fpM, что пир инкубировании смеси мембран жировых глобул молока коров используют буфер с рН 4,5 — 5,0 и немеченый пролактин в кон центрации 0,84 — 120 нМ.

Проведение рецепторного анализа в кислой среде увеличивает точность и чувствительность способа, так как в интервале рН 4,5 — 5,Ь обеспечиваются оптимальные условия специфического связывания пролактина с мембранами жировых шариков молока коров.

Использование инкубационного буфера с рН 4,5 — 5,0 позволяет получить достоверные значение содержания рецепторов в лактогенных гормонах.

При значении рН инкубационного буфера менее 4,5 пролактин выпадает в осадок, что ведет к искажению данных о количестве пролэктина и препятствует проведению рецепторного анализа, При значениях рН больше 5,0 снижается процесс специфического связывания пролактина с мембранами жировых шариков молока, вследствие этого уменьшается точность и чувствительность способа, Влияние рН на специфическое связывание пролактина с мембранами секреторных клеток молока крольчих известно: традиционное значение рН инкубационного буфера составляет 7,4 — 7,5. Влияние рН на специфическое связывание пролактина с мембранами жировых шариков молока коров неизвестно, Уточнение диапазона концентрации немеченого пролактина, добавляемого в инкубационный буфет, позволяет сократить объем экспериментов и увеличить точность способа, так как в нужном диапазоне кон. центрации немеченого пролактина получают больше данных по связыванию пролактина с лактогенными рецепторами мембран жировых глобул молока.

С использованием математических методов при обработке полученных данных более точно определяется концентрация лактогенных рецепторов мембран жировых глобул молока коров.

Выбор оптимальных концентраций немеченого пролактина обусловливается свойствами исходного рецепторного материала, а именно константами сродства пролактина и лактогенных рецепторов, а также концентрацией лактогенных рецепторов, Эти свойства изучены для лактогенных рецепторов, локализованных на плазматических мембранах секреторных клеток тканей различных органов, Для мембран жировых глобул молока рецепторный анализ проведен только у кроликов.

20 где  — количество специфически связанного гормона;

L — равновесная концентрация свободного гормона, и — количество центров связывания.

Для определения параметров системы (К и Q) наиболее часто применяют методы, основанные на преобразовании уравнения (1) к виду, удобному для графического определения параметров. Широкое распространение в настоящее время получило представление данных по гормон-рецепторному взаимодействию в координатах

35 Скзтчарда

Всп/L = g (Ql/Ki — (1/Kl) В ) (2) 40 где  — количество гормона, специфически связанного с центром связывания.

В случае одного типа рецепторов это уравнение характеризует линейную зависимость между отношением количества свя45 занных и свободных молекул гормона (В,„gi) и концентрацией гормон-рецепторного комплекса (В я), График этой зависимости представляет собой прямую линию с наклоном—

1/К, которая отсекает на оси ординат отрезок, равный Q/Ê, а на оси абсцисс Q.

В случае существования 2 типов рецепторов график Скэтчарда представляет собой вогнутую кривую, асимптоты к которой отсекают на оси ординат отрезки, равные 0>/К> и Qg/К, а на оси абсцисс Qi и 07.

Пример, Берут 400 мл молока коровы, центрифугируют в течение 30 мин при 18000

g. Полученные сливки промывают трехкратно 0,25 M раствором сэхарозы (10 m М

Впеозые установлен оптимальный диапазон концентрации немеченого пролэкти. на для проведения рецепторного анализа мембран жировых глобул молока коров, 5 Константу диссоциации (К) и непосредственно концентрацию рецепторов (Q) определяют по графику Скэтчарда методом регрессионного анализа (с помощью программы

"Дельта", разработанной в МГК, для двух10 центровой модели связывания).

Указанные параметры являются основ-ными физико-химическими параметрами, характеризующими процесс комплексообразования, Модельная функция, описывающая

15 связывание лиганда со специфическими центрами, имеет вид

МоО ), замораживают в концентрации 35 но о I "пролак ина <. мембранами жировых по жиру при -40 С в течение 18 ч. Затем глобул молока. Этим объясняются граничо сливки нагревают до 36 С, центрифугируют ные значения концентрации немеченого в течение часа при 100 000 Q(4 С), Осадок пролактина, взятые в пределах от 0,84 до промывают 2 раза 0,04 M фосфатно-цитрат- 5 120 нМ, ным буфером с рН 4,8 (10 m M MQClz), осаж- Результаты излучения влияния величидают при центрифугировании в течение ны рН инкубационной среды на специфичечаса при 100 00 g (4 С), ское связывание пролактина представлены

Полученные мембраны гомогенизируют в табл. 3 и фиг. 2, в промывочном буфере и определяют кон- 10 Результаты экспериментов подтвержцентрацию белка методом Лоури. В 14 про- дают правильность выбора значений рН инбирок, содержащих по 05 мл мембран в кубационного буфера. равных 4,5-5,0, и концентрации 100 мкг/мл по белку, добав- концентрации пролактина, равной 0,84 — 120 ля т 01 ю по 0,1 мл меченого I пролактина, нМ, использование которых позволяет по(100000импульсов/мин) и по0,05мл немечено- 15 высить точность способа определения лакIo пролактина с различной концентрацией тогенных рецепторов в молоке корок, Процент специфического связывания проВ контрольной робе (1) немеченый лактина с жировыми шариками молока пролактин отсутствует, Вместо него добав- крольчихи в способе-прототипе равен 25ляют0,05 мл буфера, Смесь инкубируют при 20 30. В предлагаемом решении он достигает

20 С втечение24ч, Свободный и связанный до 43 /, т.е. йа 13-18 выше. Влияние конс мембранами пролактин разделяют цент- центрации немеченого пролактина на сперифугированием проб, надосадочную жид- цифическое связывание меченого кость отсасывают. Радиоактивность осадка пролактина показано в табл. 2, определяют на приборе "Сотри-Gamma" 25 Следовательно, предлагаемый способ (фирма, LKB). Константу диссоциации и" кон- повышает точность и чувствительность иэцентрацию рецепторов определяют по гра- вестного способа, высокоэффективен при фику Скэтчарда методом регрессионного использовании в научных и "диагностичеанализа, в котором используют полученные ских исследования, так "как получение больданные о количестве меченого пролактина, 30 шого количества мембран жировых глобул связанного с мембранами жировых глобул из молока коров дает возможность провомолока коров, Зная удельную активность дить параллельные исследования, повышамеченого пролактина, а также количество ющие надежность предлагаемого способа. добавленного к мембранам меченого и натив- Формула изобретения ного пролактина, вычисляют концентрации 35 Способ определения концентрации лакспецифически связанных (В) и свободных тогенных рецепторов, предусматривающий молекул гормона (L), а также их отношение выделение мембран элировых глобул из (В/1 ). Представив таким образом экспери- исследуемых проб молдка с последующим ментальные данные(В/L от В, фиг. 1), мето- . рецепторным анализом в присутствии мечедом регрессии определяют параметры 40 ного I и немеченого пролактина, инкуби г взаимодействия. На фиг, 1 пунктиром изо- рование в буфере, центрифугирование, бражена линия регресс и, вычисленная по установление количества связанного меуравнению 1 с помощью определенных па- ченого пролактина по радиоактивности раметров взаимодействия. Параметры вза- полученного осадка и определение конимодействия пролактина с рецепторами 45 центрации лактогенных рецепторов в замембран жировых глобул молока коров по- висимости от установленного количества казаны в табл. 1. связанного меченого пролактина, о т л и ч а юОбработку экспериментальных данных шийся тем, что, с целью повышения проводят на ЭВМ с помощью программы точности и расширения функциональных

"Дельта", разработанной в МГУ, 50 воэможностей, выделение мембран жироКак свидетельствуют данные табл. 2, вых глобул осуществляют из исследуемых при концентрации добавляемого немечено- проб молока коров, причем немеченый прого пролактина боле 120 нМ обеспечивается лактин используют в концентрации 0,84только неспецифическое связывание мече- 120 нМ, а буфер с рН 4,5-5,0.

Iib1b65

1аблица I

Константа со иа ии, нМ

Таблица 2

Таблица 3

Пример

Специфическое связывание, 4,4

40,0

5,6

3,0

3

5

Значения рН инкуба ионного буфера

4,5

4,7

4,9

5,0

5,2

43.0

40.5 за,о

30,0

18,0

Я

0,532

11,575

Характер специфического связывания

Начинается выпадение пролактина в осадок

Наблюдается высокое специфическое связывание пролактина

Снижается процесс специфического связывания

Н вязывание

1751665

1751665

ЗО

Ф, 5; 5;,, рн

Влияние рн инкубационного 6цФера на соеиеФическое сбяэь!Ьание с ММ

Эиа2

Составитель

Техред М. Моргентал

Редактор А,Долинич

Корректор Т.Вашкович

Производственно-издательский комбинат "Патент". г, Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 2688 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5