Способ фиксации первичных гепатоцитов для экстракорпорального контура искусственной печени

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: первичные гепатоциты фиксируют непосредственно на поверхности носителя - пенистого отжрытопористого гидрофильного полиуретана.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4749107/13 (22) 12.10.89 (46) 30.07,92, Бюл, N 28 (71) Университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы (72) В.А.Радюхин (SU), Мануэль Леопольдо

Пастенес Муньес (CL), В.П.Деревянко и

О.А.Кокоревская (56) Патент Великобритании

М 2178447, 1987.

Demetrlon А,А., Whiting T. — Апл. Surg.;

1986, ч. 204, М 3, р. 259.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к носителям для культивирования клеток человека и животных, и может найти применение в медицине для создания устройств искусственной печени.

Проблема носителей для культивирования субстрат-зависимых клеток является одной из актуальных в клеточной биологии и биотехнологии, при этом, наряду с биоафинностью и нетоксичностью, в ряде случаев важнейшей характеристикой является развитость поверхности субстрата. позволяющая создавать высокое отношение поверхности культивирования к его объему, Так, известен носитель, состоящий из физиологически приемлемой сетки волокон, имеющих пористость 40-95% и поры размером

10-100 мкм или открытопористую пенистую структуру, Получение и поддержание краткосрочной первичной культуры печени!и vitro является трудной и не до конца решенной задачей, так как гепатоциты обладают повышенной требовательностью к условиям культивирования и, особенно, к носителю, к которому они прикрепляются. Адгезия первичных гепатоцитов на негоризонтальных поверхностях особенно затруднена вследЯ2,, 1751200 А1 (54) СПОСОБ ФИКСАЦИИ ПЕРВИЧНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ ДЛЯ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО КОНТУРА ИСКУССТВЕННОЙ

ПЕЧЕНИ (57) Использование: биотехнология. Сущность изобретения: первичные гепатоциты фиксируют непосредственно на поверхности носителя — пенистого открытопористого гидрофильного полиуретана. ствие их высокой склонности к седиментации и неустойчивости к механическим воз-, Я действиям, Существует способ присоединения гепатоцитов к коммерческому микроносителю на декстрановой основе ("Цитодекс"), покрытому коллагеном, с использованием в модельном устройстве искусственной печени.

Однако в такой системе гепатоциты располагаются на наружной стороне сферической поверхности и легко подвергаются механическому разрушению трущимися друг о друга частицами микроносителей, а также могут смываться тбком окружающей жидкости. Сами частицы создают значительное гидродинамическое сопротивление току жидкости и тем самым сильно ограничивают скорость протока жидкой среды через колонку с микроносителем.

Цель изобретения — уменьшение травматизации клеток и поддержание полноценного массообмена гепатоцитов с омывающей средой.

Цель достигается тем, что согласно способу фиксации первичных гепатоцитов, включающему посадку гепатоцитов на поверхность носителя, в качестве носителя используют открытопорйстый гидрофильный

1751200

Формула изобретения

Способ фиксации первичных гепатоцитов для экстракорпорального контура искусственной печени, включающий посадку гепатоцитов на поверхность носителя, о.тл и ч а ю шийся тем, что, с целью уменьшения травматизации клеток и поддержания полноценного массообмена гепатоцитов и среды, в качестве носителя используют пенистый открытопористый гидрофильный полиуретан.

Составитель И. Тареева

Редактор Н, Швыдкая Техред M.Moðãeíòàë Корректор T. Палий

Заказ 2664 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035; Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 полиуретан, непосредственно на поверхность которого фиксируют гепатоциты.

Сущность заключается в применении в качестве нового субстрата-носителя для первичных гепатоцитов биосовместимого, 5 нетоксичного, технически простого, функционально эффективного, доступного и дешевого полиэфирно-полимочевинного препарата с открытопористой пенистой структурой. Структура данного матрикса 10 представляет собой нерегулярную систему

riop, разделенных тонкими пленочными перегородками; с отверстиями между ними

100 — 500 мкм. Гепатоциты, проникая через отверстия в перегородках, задерживаются 15 внутри пор и прикрепляются к стенкам внутри. Таким образом достигается защитный эффект от внешних механических воздействий на клетки и в то же время сохраняется свободный массообмен их с окружающей 20 жидкой средой. Существенным преимуществом является и простота технологии получения такой системы культивирования гепатоцитов.

До настоящего времени использование 25 гидрофильного полиэфирно-полимочевинного открытопористого пенополиуретана в качестве носителя для культивировайия эукариотических клеток, в том числе первичных гепатоцитов, не было известно. 30

Способ осуществляют следующим образом.

Гидрофильный открытопористый пенополиуретан механически измельчают в водной среде в измельчителе ткани с 35 получением кусочков неправильной формы поперечным размером 3-6 мм. Суспензию пенополиуретана тщательно отмывают раствором детергента, водой, спиртом, стерилизуют автоклавированием в водной среде 40 и отмывают питательной средой для культуры клеток, затем выдерживают 12 ч в питательной среде, содержащей 107; фетальной телячьей сыворотки.

Из суспензии формируют колонку с со- 45 отношением высоты к ее диаметру не менее

3,0-3,5 и удаляют избыток питательной среды, На колонку наносят сверху суспензию свежевыделенных первичных гепатоцитов (1,5х10 клеток в 1 мл) крысы и медленно

6 профильтровывают ее через колонку (23 мл/мин), собирая элюат снизу. Данную операцию повторяют дважды, В результате не менее 50 — 607, клеток задерживается на колонке.

Жизнеспособность клеток, оставшихся в среде после колонки, подтверждалась визуально под микроскопом, подсчетом клеток в суспензии до и после фильтрования через колонку определяли количество задержавшихся клеток. В отработанных условиях в 100 мл скомпанованного матрикса-носителя задерживалось 3040х10 клеток, Колонку промывают питательной средой, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и оставляют в СО2-инкубаторе на

18 ч для закрепления клеток на носителе.

Контроль адгезии гепатоцитов на носителе осуществлялся с помощью сканирующей электронной микроскопии образцов, Таким образом, применением данного пенополиуретана достигается высокое соотношение площади культивирования первичных гепатоцитов к его объему, эффективная защита эаключенных внутри пор клеток от внешних воздействий, а также эффективность массообмена клеток с омывающей жидкой средой,