Способ получения эмбриональных клеток двустворчатого моллюска мizuснорестеn yessoensis

 

Использование: изобретение относится к клеточной биологии, к способам культивирования клеток беспозвоночных животных, а именно эмбриональных клеток морского двустворчатого моллюска. Сущность изобретения: отдельные клетки приморского гребешка получают диссоциацией эмбрионов 0,1%-ным раствором коллагеназы на искусственной морской воде без Са+2 и Мд 2. Культивируют клетки в питательной среде, доукомплектованной сахарами, аминокислотами с добавлением эмбриональной сыворотки теленка, во флаконах, предварительно обработанных коллагеном . уЁ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s»s С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOIVlY СВИДЕТЕЛ6СТВУ (21) 4796073/13 (22) 25.01.90 (46) 07.07.92. Бюл, йг 25 (71) Институт биологии моря Дальневосточного отделения АН СССР (72) Н.А. Одинцова и А.В. Хомченко (53) 578.085.23(088.8) (56) Brewstev E„Nicholson ВЛ. In vitro

maintenance of amoebocytes from the

American oyster (Crassostrea virglnlca). — J.

Fich, Ros. Board. Can. 1979. 36, 461-.467.

Hetrick F.M„Stephens E.1 отах N, Attempts to develop à maf inc molluscan cell

l l ne. — Technical Report of $еа Grant. 1981. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК ДВУСТВОРЧАТОГО МОЛЛЮСКА MIZUCHOPECTEN YESSOENSIS

Изобретение относится к клеточной биологии, к способам культивирования клеток беспозвоночных животных, а именно эмбриональных клеток морского гребешка, и может быть использовано в биотехнологии, медицине, а также в научно-исследовательской работе для получения культуры клеток.

Известен способ получения эмбриональных клеток устрицы; где эмбрион выращивают до стадии трохофоры, обрабатывают раствором коллагеназы и гиалуронидазы; подвергая затем механической обработке. Далее клетки культивируют в морской воде с добавлением гемолимфы (2%), водо росл ев о го гидрол изата (5 ), устричного эмбрионального экстракта (5%) и FCS(10% эмбриональная сыворотка теленка).

„, Ы „„1745767 А1 (57) Использование: изобретение относится к клеточной биологии, к способам культивирования клеток беспозвоночных животных. а именно эмбриональных клеток морского двустворчатого моллюска. Сущность изобретения: отдельные клетки приморского гребешка получают диссоциацией эмбрионов 0,1%-ным раствором коллагеназы на искусственной морской воде без Са и

Mg . Культивируют клетки в питательной среде, доукомплектованной сахарами, аминокислотами с добавлением эмбриональной сыворотки теленка, во флаконах, предварительно обработанных коллагеном.

Недостаток данного способа заключается в том, что время переживания культуры клеток всего две недели. 3

Наиболее близким по технической сущ- ф ности к изобретению является способ пол- (Я учения культуры эмбриональных клеток устрицы. Эмбрионы устрицы получают пу- О тем искусственного оплодотворения, выращивают до стадии трохофоры, диссоциацию на составляющие клетки проводят раствором трипсина 0,025 — 0,25% без ионов Са и

Mg с добавлением ЭДТА (раствор смягчают добавлением буферных солей). Затем проводят культивирование клеток в питательной среде. состоящей из 30% среды

Лейбовича (1-15}, 43% морской воды, 10 эмбриональной сыворотки телят, 2,5% устричного личиночного экстракта, 2.5% водорослевого экстракта, 5 мг/мл глюкозы, 0,65

1745767

20

30

45

1 мг/мл галактозы, 0,4 мгlмл дрожжевого экстракта.

Клетки культивируют либо в необработанных флаконах либо во флаконах, обработанных полилизином либо фибронектином, либо коллагеном тип 1И, но не из мышиных хвостов. Время переживания культуры клеток 1 мес. Добавление тканевых фрагментов взрослых устриц к эмбриональным культурам увеличивает временной период жизнеспособных клеток до 2 мес.

Недостатком способа является меньшее, чем в экспериментах, время переживания культивируемых клеток, что связано с особенностями используемой в среде и субстратов, неэффективность использования субстратов (полилизин, коллаген не из мышиных хвостов) для увеличения клеточного прикрепления и клеточного роста.

Цель изобретения — увеличение длительности переживания клеток.

Для достижения цели эмбрионы гребешка, полученные путем искусственного оплодотворения, выращивают до стадии трохофоры (30 — 48 ч при 14 С), затем диссоциируют на составляющие их клетки в

0,1%-ном растворе коллагеназы на искусственной морской воде беэ Са+. и Mg+ в течение 1-1,5 ч при 6 — 10 С, пипетируют, промывают дважды в морской воде с антибиотиками и культивируют в питательной среде L-15 (Flow), доведенной основными солями до осмотичности гемолимфы гребешка (110 мОсмоль) и содержащей 1-5% эмбриональной сыворотки телят, таурин, глюкозамин, глютамин во флаконах, предварительно обработанных коллагеном из мышиных хвостов (1 мг/мл).

Источником клеток для получения исходной культуры служат полученные путем искусственного оплодотворения эмбрионы Приморского гребешка. Нерест моллюсков индуцируют инъекциями 0,5-1 мл 10 M раствора серотонина креатинсульфата в гонаду. Эмбрионов выращивают до стадии. трохофоры — велигера (30 — 48 ч при 14ОC).

Деэаггрегацию проводят с помощью

0,1% коллагеназы, что дает наиболее стабильные результаты, при этом количество мертвых клеток не превышает 10 и кусочки тканей эмбрион диссоциируют на клетки почти полностью, Пример 1. Источником исходных клеток служат эмбрионы гребешка, полученные путем искусственного оплодотворения. Нерест моллюсков индуцируют инъекциями 0,5 — 1 мл 10 М раствора серотонина креатинсульфата в гонаду. Сбор яйцеклеток и спермиев проводят в морской воде, стерилизованной облучением ультрафиолетом, при 14-15 С..Оплодотворенные яйцеклетки отмывают от спермиев и культивируют в закрытых сосудах со стерильной морской водой при постоянном поддуве стерильным воздухом для аэрации и перемешивания, Смену воды проводят через 20 ч при достижении личинками стадии плавающей бластулы. Эмбрионов выращивают до стадиитрохофоры(30ч при14 С),собирают с помощью газа (30 мкм), промывают искусственной морской водой без Са+2 и затем центрифугируют для концентрирования в небольшом объеме.

Обработку эмбрионов проводят 0,1%ным раствором коллагеназы (производство

ТИБОХ ДВО АН СССР) в течение 1 ч при

10 С. Полученную массу пипетируют в течение 1 мин для разделения оставшихся агрегатог на отдельные клетки, центрифугируя (2 тыс. об/мин, 10 мин), промывают дважды в стерильной морской воде с антибиотиками (пенициллин 500 ед/мл. гентамицин 40 мкг/мл), а затем переводят в питательную среду (гентамицин 40 мкг/мл).

В качестве питательной среды используют стандартную среду Лейбовича-15, которая содержит большие концентрации аминокислот, что характерно и для гемолимфы морских моллюсков. К среде добавляют таурин (25 мг/л); глюкозамин 50(мл/л), глютамин (100 мг/л). эмбриональную сыворотку телят 2%. Среду предварительно доводят по основным солям до осмотичности гемолимфы гребешка 11100 мОсмспь). Суслеиеию: клеток (0,5-10 клеток/мл) рассеивают в культуральные флаконы Карреля и пробирки Лейтона. предварительно обработанные коллагеном из мышиных хвостов (Slgf1la) 1 мг/мл в течение 6 ч и промытые дважды . морской водой, помещают в термостат при

15 С. Через сутки после посева производят смену среды путем центрифугирования и ресуспендирования осадка клеток в свежей порции среды. Последующие смены среды проводят через каждые 10 дней в течение

2 мес, а затем через 20 дней. Жизнеспособность клеток в начальный момент посева оценивают с помощью окраски трипановым синим (0,04%-ный раствор на морской воде), акридиновым оранжевым (0,01-0,001 -ный раствор); двойным флуоресцентным методом (0,001 -ный раствор флуоресцеин диацетата: 0,0003%-ный раствор пропидиума иодида), а на дальнейших сроках культивирования — двойным флуоресцентным методом. Жизнеспособность клеток в момент посева 90% а затем постепенно снижается до 80% (2 мес культивирования) и до 60% (4 мес культивирования).

1745767

Пример 2. Исходную массу отдельных клеток получают как описано в примере 1, но обработку коллагеназой ведут при 6 С

1,5 ч.

Полученную массу клеток ресуспендируют в среде Лейбовича, доведенной основными солями до осмотичности гемолимфы гребешка 1100 мОсмоль, содержащей таурин (25 мг/n); глюкозамин (50 мг/л); глютамин (100 мг/л); эмбриональную сыворотку телят 5®, гентамицин (40 мкг/мл). до концентрации 1 10 клеток в 1 мл питательной среды; Клетки культивируют в предварительно обработанных флаконах Карреля объемом10 мл и 50 мл при 10 С. Через сутки после посева производят смену среды, последующие смены среды проводят каждые

15 дней.

Жизнеспособность клеток и их способностьсинтезировать РНКи ДНК проверяют, как описано в примере 1..

В данном случае клетки сохраняют свою жизнеспособность и активность до 95 сут (к концу культивирования жизнеспособность падает до 60-70-",ъ).

Пример 3. Исходную массу клеток получают иэ эмбрионов со стадии велигер (48 ч при 14ОС), как описано в примере 1.

Клетки ресуспендируют в среде Лейбовича, доведенной основными, солями до 1100 мОсмоль, содержащей глюкозамин (50 мг/л), глютамин (100 мг/мл), 2 эмбриональную сыворотку телят, добавляют антибиотик — гентамицин (40 мкг/мл) до концентрации 0,5 10 клеток в 1 мл питательной среды.

Клетки культивируют в предварительно обработанных коллагеном (1 мг/мл) флаконах Карреля объемом 10 мл при 20ОС. Через сутки после посева производят смену среды, последующие смены среды проводяг каждые 10 дней, Жизнеспособность клеток оценивают, как в примере 1.

В данном примере клетки сохраняют свою жизнеспособность и активность в течение 122 дней, Пример 4. Полученную, как описано в примере 1, массу отдельных клеток эмбрионов гребешка ресуспендируют в среде

Лейбовича, содержащую таурин (50 мг/мл), глюкозамин (150 мгlл), глютамин (100 мгlл), эмбриональную сыворотку телят (1 ) с добавкой гентамицина (40 мкг/мл), и доводят основными солями .до 1100 мОсмоль, до концентрации 0;5 10 клеток в 1 мл питательной среды.

Клетки культивируют в предварительно обработанных коллагеном (1 мг/мл) флаконах Карреля при 15 С. Через сутки после посева производят смену среды, последую5 щие смены среды проводят каждые 15 дней.

Жизнеспособность клеток оценивают, как в примере 1.

В данном случае клетки сохраняют свою жизнеспособность и активность в течение

10 95 сут(к концу культивирования жизнеспособность клеток падает до 60%, но и на этой стадии на препаратах обнаружены клетки в различных стадиях митоэа (0,02-0,03 ).

Таким образом, как видно иэ приведен15 ных примеров, предлагаемый способ позволяет получить культуру переживающих эмбриональных клеток двустворчатого моллюска Mlzuchopecten yessoensls и обеспечить их жизнеспособность в течение более

20 чем 3 мес (95-122 дней). Эта задача является актуальной, поскольку известно значительное количество фармакологически и биохимически ценных соединений, выделенных из морских организмов. Для получения та25 ких соединений необходимы, как правило, большие количества животных, многие из которых труднодоступны или малочисленны. Поэтому очевидно; что производство биологически активных веществ из морских

30 организмов должно быть основано на культурах клеток-продуцентов. Такой подход целесообразен также с экологической точки зрения. Кроме того, морские животные являются незаменимыми объектами эмбрио35 логии, биологии клетки и молекулярной биологии, Формула изобретения

Способ получения эмбриональных кле40 ток двустворчатого моллюска

Mlzuchopecten yessoensis, включающий получение эмбрионов на стадии трохофоры велигера, диссоциацию .эмбрионов путем ферментной и механической обработки и

45 культивирование в. питательной среде, состоящей из среды Лейбовича и эмбриональной сыворотки во флаконах, обработанных коллагеном,отл ича ю щи йс ятем, что,c целью увеличения длительности пережива-.

50 ния клеток, ферментную обработку проводят .0,1ф>-ным раствором .коллагеназы, а питательная среда содержит 95-98 среды

Лейбовича, до 5ф эмбриональной сыворотки, 25-50 мг/л таурина, 50 — 150 мг/л глюко55 замина, 100 мг/л глютамина и основные соли, добавленные до осмотического давления 1100 мОсмоль.