Способ определения кейлонов

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения кейлонов. В основу способа положена способность нормальных (неопухолевых ) клеток некоторых органов мыши под действием ингибиторов - кейлонсодержащих экстрактов (КСЭ) - обесцвечивать метиленовую синь в анаэробных (бескислородных) условиях. Цель - повышение чувствительности и1 ускорение способа. Ингибитор вносят в клеточную систему, представляющую собой взвесь клеток некоторых органов мышей. Клеточную систему соединяют с агаром специального состава, содержащим краситель, при этом регистрацию результатов проводят по изменению окраски агара.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbfTHRM

ПРИ ГКНТ СССР

I (21) 4452400/14 (22) 20.05.88 (46) 07.05.92. Бюл. ¹ 17 (71) Владивостокский государственный медицинский институт (72) Н.С.Мотавкина, Л.Н.Федянина и Н.P.Êóñòîâà (53) 612.015 (088.8) (56) Иммунология, 1981, № 4, с. 1220. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ. КЕЙЛОНОВ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения кейлонов. В основу способа .

Изобретение. относится к медицине и может быть грименено для выявления и тестирования кейлонов и других биологически активных веществ.

Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорение способа определения кейлонов.

В основу способа определения кейлонов положена впервые обнаруженная способность нормальных (неопухолевых) клеток, органов мыши (печень, сепе-. зенка, тимус, легкое) под действием соответствующих кейлонсодержащих экстрактов (КСЭ) обеспечивать. краситель (метиленовую синь) в анаэробных (бескислородных) условиях.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят клеточную суспензию из печени, тимуса, легкого, селезенки мышей, затем готовят агар и выделяют ингибитор из органов животных (бык) „„ЯЦ„„1732270 А 1 (g1)g С 01 И 33/48, А 61 K 37/02

2 положена способность нормальных (неопухолевых) клеток некоторых органов мыши под действием ингибиторов — кейлонсодержащих экстрактов (КСЭ) обесцвечивать метиленовую синь в анаэробных (бескислородных) условиях.

Цель — повышение чувствительности и ускорение способа. Ингибитор вносят в клеточную систему, представляющую собой взвесь клеток некоторых органов мышей. Клеточную систему соединяют с агаром специального состава, содержащим краситель, при этом регистрацию результатов проводят по изменению окраски агара. и органов морских млекопитающих по известному способу. Для выделения „ действующего начала используют фракционированное спиртовое осаждение белковых компонентов водных экстрактов. После этого соединяют клеточную взвесь, КСЭ и агар, Затем проводят учет результатов по степени обесцвечнвания столбика агара.

Пример 1.- Приготовление клеточной суспензии: забивают мышь и фиксируют на столике. Выделяют отдельно селезенку, печень, легкое тимус, очищают их от жира и соединительной ткани, переносят в чашки Петри с

0,5-0,8 мл среды 199 и каждый орган фрагментируют ножницами до получения. однородной клеточной взвеси. К полученной смеси добавляют 2-2,5 мл среды 199 и фильтруют ее через капроновую сетку в центрифужную пробирку.

Дважды отмывают средой 199 при цент2270 4 не дает визуально регибрнруемые изме.50

- 0 нения, т.е. просто не видна в пробир. ке. Концентрация метиленовой сини более 1:50000-1:60000 ведет к неполному, ее обесцвечиванию клетками и нарушению результатов реакции.

3 рифугировании в течение 5 мин при !

000 об/мин. Супернатант удаляют, а к осадку добавляют свежей среды 199 и ресуспендируют пастеровской пипеткой. В камере Горяева подсчитывают количество клеток в одном миллиметре клеточной суспензии. Доводят концентрацию клеток до 250000-300000 в одном миллнлитре разведением средой 199.

Приготовление агара. Расплавляют<

0 5-fX-ный агар на фосфатном буфере (1/15 М, рН 7) и к нему добавляют 34 .-ную глюкозу. После охлаждения агара до 45 С в среду вносят краситель (метиленовую синь) до конечного разведения 1:50000"1:60000.

Выделение ингибитора. Кейлонсодержащие экстракты готовят из органов быка и органов моржа. Для этого у животного выделяют селезенку, печень, легкое, тимус, промывают их теплым физиологическим раствором. Затем измельчают ткань в гомогенизаторе,.добавляя дистиллированную воду в соотношении 8:1. После замораживания при

-20ОС и оттаивания суспенэию пропускают через марлевый. фильтр.и измеря.ют конечный объем, исходя из которого добавляют холодный 96 -ный этиловый спирт до конечной концентрации 70 . о

После выдерживания смеси при 4 С в тетечение 1 ч образовавшийся осадок отделяют 10-минутным центрифугированием при 3000 об/мин. К надосадочной жидкости вновь добавляют 96 -ный зтанол, доводя его концентрацию до 81 . Осажденную 81 -ную спиртовую фракцию лиофильно высушивают. Из высушенных экстрактов делают навески 100, 200, 300 мкг. Каждую навеску растворяют в

0,5 мп физиологического раствора.

Готовят ряд пробирок, наливают в каждую 0,5 мл клеточной взвеси, saтем в 1,2,3-ю пробирки вносят КСЭ до концентрации 100, 200, 300 мкг в

0,5 мл соответственно. В каждую пробирку добавляют по 2 мл arapa. Конечная концентрация ингибитора составляет соответственно 33, 3, 66,6, 100 мкг/мл. В контрольную пробйрку вместо КСЭ вносят 0,5 мл физиологи- ческого раствора. Такой ряд пробирок1 используют для каждого набора клеток из различных органов - печени, селезенки, легкого тимуса - и добавляют в пробирки соответствующие кейпонсодержащне экстракты иэ тканей животных.

Пробирки помещают в термостат при

37 С, учет результатов проводят через сутки.

В контрольной пробирке, содержащей физиологический раствор, столбик araра остается синим.

В пробирке Р 1 с конечной концентрацией ингибитора 33,3 мкг/мл происходит обесцвечивание столбика агара на одну треть. Интенсивность реакции +.

В пробирке У 2 происходит обесцвечивание столбика arapa на две трети (конечная концентрация ингибитора

66,6 мкг/мл). Интенсивность реакции

++ °

В пробирке У 3 с конечной концентрацией ингибитора 100 мкг/мл происходит полное обесцвечивание столбика

1 агара. Интенсивность реакции +++.

Пример 2. Все операции проводят аналогично примеру 1. Изменяют концентрации агара и глюкозы: 0,5-1 ный агар обеспечивает необходимую диффузию ингредиентов реакции, агар плотной концентрации (более 1 ) препятствует диффузии ингредиентов реакции, агар менее плотной концентрации не дает достаточной плотности состава, не удерживает ингредиенты, переместившиеся в результате диффузии.

3-4 -ная глюкоза используется как поглотитель кислорода, ее концентрация менее 3-4 не обеспечивает поглощения всего находившегося в растворе кислорода и не создает аназробных условий, концентрация глюкозы более 4 нарушает химический состав среды н препятствует прохождению реакции.

Пример 3. Все операции проводят аналогично примеру 1. Изменяют концентрацию метиленовой сини. Концентрация метиленовой сини в разве-дении 1:50000-1:60000 дает возможность по изменившейся окраске, т.е. обесцвечиванию метиленовой сини, визуально оценивать результаты реакции.

Меньшая концентрация метиленовой сини

Данный способ позволяет повысить, чувствительность определения кейлонов в кейлонсодержащих экстрактах в 10Составитель А. Скурат

Редактор М.Стрельникова Техред А.Кравчук

Корректор С.Иекмар

Заказ 1580 Тираа Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР !

13035, Москва, И-35, Рауиская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.уигород, ул. Гагарина, 101

5 1732270 6

100 раз и ускорить его в 5 раз по лью повышения чувствительности спосо+ сравнению с прототипом. ба и его ускорения, в качестве кле" ф о р м у л а и з о б р е т е н и я точной системы используют взвесь клеСпособ определения кейлоновю в 9 ю " ток печени или селезенки легких, ти5 тичаощий введение кейлонсодераащего муса мыюи, в качестве агара испольэусубстрата в клеточную систему лосле ют агар, содераащий глюкозу и метнледующее внесение полученной смеси в новую синь, при этом регистрацию реагар и регистрацию результатове o v эультатов проводят по обесцвечиванию л и ч а ю шийся тем, что, с це агара.