Способ получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы
Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы, которая находит применение в клинико-химической диагностике для количественного определения кетонных тел. Цель изобретения - снижение себестоимости конечного продукта. Изобретение состоит в том, что штамм Pseudomonas putida ATCC 17633 выращивают на тех субстратах, при распаде которых возникают ацетоацетат или гидроксибутират являющиеся одновременно источниками углерода. К ним относятся D, L-лейцин, D, L-лизин, D, L-каротин, алифатические углеводороды с длиной цепи Сб-Сю. Культивирование ведут в течение 15-40 ч, а хроматографическую очистку фермента осуществляют на 10-карбоксидецилсефарозе. 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАР СТВ Е ННЫ Й КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
1 (89) OO//È/P 149874 (48) 05.08.81 (21) 7771547/13 (22) 31.12.80 (31) WP С120/220060 (32) 31.03.80 (33) 00 (46) 07.05.92, Бюл. ¹ 17 (71) Университет им. Карла Маркса (D0) (72) Вульфдитер Шепп и Ганс Петер Клебер (00) (53) 577.15 (088.8) {54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-ГИДРОКСИБУТИ РАТДЕ ГИДРОГЕ НАЗ Ы (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы, которая находит
Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы. который находит применение в клинико-химической диагностике для количественного определения кетонных тел.
Известен способ получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы, Для этой цели выращивают бактериальный штамм
Rhodopseudomonas sphегоides на 3-гидроксибутирате, как источник углерода, затем отделяют бактерии посредством центрифугирования, обрабатывают их и подвергают свободный от клеток белковый экстракт, имеющий начальную активность порядка
0,1 моль/мин/мг белка, воздействию протаминсульфата для осаждения и последующего удаления нуклеиновых кислот. После фракционирования посредством аммонийсульфатного осаждения соответствующая фракция отделяется, промывается, раство А 1731813 А1
Pseudomonas putida АТСС 17633 выращивают на тех субстратах, при распаде которых возникают ацетоацетат или гидроксибутират, являющиеся одновременно источниками углерода. К ним относятся D, L-лейцин, О, L-лизин, D, L-каротин, алифатические углеводороды с длиной цепи Св†- С1о, Культи, вирование ведут в течение 15 — 40 ч, а хроматографическую очистку фермента осуществляют на 10-карбоксидецилсефарозе. 2 табл, ряется в буфере и очищается или же обогащается многократно хроматографически до активности порядка 17 моль/мин/мг белка. Способ имеет тот недостаток, что конечный продукт очень дорог, особенно если дело касается сильно обогащенной 3гидроксибутиратдегидрогеназы, Причина не только в трудоемкости операции очистки, но и в высокой стоимости субстрата для культивирования. Недостаток состоит и в том, что активность получаемого фермента не превышает значения в 17 — 20 моль/мин/мг белка. Причина в том, что применяемый штамм Rhodopseudomonas sphегоides не в состоянии производить фермент с более высокой начальной активностью, чем вышеописанной. Наиболее близким к предлагаемому по технической сути является способ получения З-гидроксибутиратдегидрогеназы, предусматривающий выращивание штамма 1731813 < 0,02 Pseudomonas lemoignei на питательной среде в присутствии цитрата и сукцината в качестве субстрата при температуре 30 С и аэрации с последующим отделением клеток, приготовлении бесклеточного экстракта фракционным осаждением сульфатом аммония и хроматографическую очистку на ДЕАЕ целлюлозе и гидроксианкатите до обогащения фермента активностью 190 ммоль/мин/мг. Способ трудоемок, В 4 частях способа осуществляют в среднем 6 единичных шагов, причем необходимое проведение диализа забирает много времени. Достигнутая высокая активность на 50 обязана активированию фермента ионами Mg, вследствие чего картина при сравнении с другими стандартными методиками изменяется. Цель изобретения — снижение себестоимости конечного продукта, Цель достигается путем выделения фермента 3-гидроксибутиратдегидрогеназы из штамма Pseudomonas putida АТСС 17633, Штамм сохраняли преимущественно на бульоне с 2 -ном агаром при 4 С в темноте. Культивирование Pseudomonas putida осуществляют в субмерсионной культуре на жидкой минимальной среде после пересевания из первичной культуры при 20 — 40 С (преимущественно при 30 С). Выращивание проводят на тех источниках углерода, при распаде которых образуются ацетоацетат и гидроксибутират. Такими источниками углерода являются, например, D, L-лизин, О, L-лейцин, D, L-карнитин и т.д, и, кроме того, неразветвленные углеводороды с длиной цепи С вЂ” С1о. В качестве источников азота применяют NH4Cl, (МН4)2$04 и т.п. После выращивания в течение времени 5 — 40 ч в зависимости от физиологического состояния и количества высеваемого материала бактерии собирают, например, путем центрифугирования, промывают фосфатным буфером и в заключение превращают в бесклеточный грубый экстракт, например, путем обработки ультразвуком при близких к точке замерзания температурах с последующим центрифугированием, Находящийся в грубом экстракте фермент проявляет в зависимости от источника углерода специфические активности (табл. 1), С помощью фракционного осаждения или же экстракции солями, например, с сульфатом аммония, осуществляют 10-15кратное обогащение фермента. Для этого целесообразным является разведение белкового экстракта с последующим осаждением подавляющего количества белка 70 -ным сульфатом аммония, 5 Полная активность остается при этом в седименте, Для дальнейшего обогащения 3гидроксибутиратдегидрогеназы осадок последовательно обрабатывают при 4 С растворами сульфата аммония, которые содержат 0,05 моль/л Трис, при понижающейся концентрации (МН4)г$04 и в каждом случае путем пятиминутного перемешивания. При этом фермент все больше растворяется. Основная масса фермента растворяется в районе концентраций между 35 и 20 насыщения раствора сульфата аммония. Фермент переосаждается путем добавления сульфата аммония до конечной кон центра ции в 50 . На гидрофобном носителе, таком как, например, 10-карбоксидецилсефароза, возможно дальнейшее обогащение фермента. При этом на колонку, заполненную 10-карбоксисефарозой, сажается фермент в 20 насыщения раствора сульфата аммония. После промывки раствором сульфата аммония этой же концентрации производят фракционное элюирование с 17 насыщения раствора сульфата аммония. В первой фракции наблюдается 4-кратное и во второй — 7кратное повышение специфической активности. Адсорбции способствуют сутруктуроформирующие ионы, такие как фосфат, цитрат и сульфат. Полученный согласно изобретению фермент хорошо сохраняется. При специфических активностях в 10 — 20 моль/мин/мг белка доказываются следующие максимальные чужеродные активости, /: Алькогольдегидрогеназа (1 Малатдегидрогеназа Л а ктатде гидрогеназа (0,001 В процессе выращивания бактериальной культуры выгодно работать со ступенчатым дефицитом кислорода. Пример. Pseudomonas putida(PpG 6) АТСС 17633 выращивают в субмерсионной культуре в жидкой минимальной среде, Среда содержит на литр: 6,97 KzHP04, 1,5 г Ма Н2РО4, 0,2 г Mg S04 7 Н20, 7,5 мг FeS04x х7 Н20, 0,75 мг MnS04 4 Н20, 0,75 мг ZnSO4 Н20, 0,15 мг CuS04 . 5 Н О, 0,15 мг CoClz 6 НгО и 0,15 мг борной кислоты, B качестве прививочных культур служат предварительные культуры, у которых к жидкой минимальной среде добавляют экстракт дрожжей (0,4 г/л) и глюкозу (10 г/л). При культивировании на О, L-карнитине последний добавляют в концентрации 2 г/л 1731813 55 как единственный источник углерода и азота, При культивировании на других источниках углерода (10 г/л) в качестве источника азота применяют NH4CI (3 г/л), После выращивания в течение 15 ч бактерии собирают центрифугированием, промывают многократно фосфатным буфером (0,067 моль/л, рН 7,5) и разрушают в заключение посредством обработки ультразвуком при 4 С, Грубый бесклеточный экстракт получают с помощью центрифугирования, разводят его 0,067 моль/л фосфатным буфером (рН 8) до достижения концентрации белка в 5-20 мг/мл, Подавляющую часть белка осаждают при 4 С из этого раствора посредством добавления сульфата аммония до 70% насыщения. Полная активность 3-гидроксибутиратдегидрогеназы находится при этом в осадке, После центрифугирования седимент суспендируют при 0 С в растворе сульфата аммония (45% насыщения в 0,05 моль/л Трис) и после этого снова центрифугируют, В седименте остается полная активность, Для дальнейшего обогащения остаток перемешивают по 5 мин при 4 С с растворами сульфата аммония, содержащие каждый 0,05 моль/л Трис-HCI, рН 8 понижающихся концентрацией. Фермент растворяется при этом в возрастающей мере, преимущественно в районе концентраций между 35 и 20% насыщения сульфатом аммония (табл, 2). Фермент переосаждают снова посредством добавления сульфата аммония до конечной концентрации в 50% насыщения. После центрифугирования фермент суспендируют в 3,2 моль/л раствора аммония, рН 7, и сохраняют при 4 С, 4ля дальнейшего обогащения 1 мл раствора фермента в сульфате аммония 20 насыщения сажают на 2-х мл колонку с 10-карбоксисефарозой. Специфическая активность составляет 11 и моль/мин/мг белка, общий белок — 1,5 мг. Полная активность остается на носителе. После промывания 10 мл раствора сульфата аммония (20% насыщения) на колонку подают последовательно по 2 мл раствора сульфата аммония (17 / насыщения). В пол5 50 ученных двух фракциях находится вся активность, но только 25 g белка, Специфическая активность составляет в! фракции 41,и моль/мин/мг белка (0,3 мг белка) и во II фракции — 80,и моль/мин/мг белка (0,1 мг белка), Суспензии фермента сохраняют в насыщенном растворе сульфата аммония. После 6 мес сохранения при 4 С потеря активности 3-гидроксибутиратдегидрогеназы не наблюдалась. Специфическая активность 3-гидроксибутиратдегидрогеазы в грубых экстрактах из Pseudomonas putida полсе роста на ацетоацетатобразующих субстратах для культивирования приведена в табл.1 Результаты очистки 3-гидроксибутиратдегидрогеназы (субстрат для культивирования D,L-карнитин) из Pseumonas putida АТСС 17633 приведены в табл.2. Получение проводили из 17 мл грубого экстракта (7,5 мг/мл белка). Формула изобретения Способ получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма рода Pseudomonas на питательной среде, содержащий источники углерода, азота, минеральные соли — сернокислый магний, фосфорнокислый однозамещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный натрий, соединения железа и хлора и воду при оптимальной температуре и аэрации с последующим отделением клеток, приготовлением бесклеточного экстракта и перевода его в белковый экстракт фракционным осаждением сульфатом аммония и хроматографическую очистку, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью снижения себестоимости конечного продукта, в качестве продуцентра используют штамм Pseudomonas putida АТСС 17633, а в качестве источника углерода — О, L-лейцин, D, 1= лизин, D, L-карнитин, алифатические углеводороды с длиной цепи Св — Сю, процесс культивирования ведут в течение 15 — 40 ч, причем хроматографическую очистку фермента осуществляют на 10-карбоксидецилсефарозе. 1731813 Таблица 1 Таблица 2 П р и м е ч а н и е, Π— осадок; Н вЂ” надосадочная жидкость, 10 Составитель И,Привалова Техред М.Моргентал Корректор М,Пожо Редактор О.Хрипта Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 1557 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
