Штамм бактерий viвriо сноlеrае 01 еlтоr - эталон для получения цитолизина

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии, касается штамма бактерий, служащего эталоном для получения цитолизина, и может найти применение при изучении механизма действия цитолизина на мембраны клеток и клеточные культуры, роли цитолизина в патогенезе заболевания. Цитолизин может использоваться при создании диагностических препаратов, получении гибридов, продуцирующих антитела к этому токсину, а также при решении вопросов таксономии холерных вибрионов. Целью изобретения является получение штамма бактерий Vibrio cholerae 01 eltor KM 169, используемого в качестве эталона для получения очищенного препарата биологически активного цитолизина . Из штамма выделен цитолизин, имеющий молекулярную массу 60 кДа, изоэлектрическую точку 6,7 и обладающий выраженной цитолитической, энтеропатогенной, летальной, отекогенной активностью. 2 ил. ел С

СОЮЗ СОНЕТСКИХ

СОЦИЛЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4836004/13 (22) 28.04,90 (46) 07.04.92. Бюл. М 13 (71) Среднеазиатский научно-исследовательский противочумный институт (72) А.О,Цитчер и В.Л.Семиотрочев (53) 669,15 (088,8) (56) Mlyake М. е.а. Purification and characterization of Vibrio metschnikovii cytolysln.—

lnfection апб Immunity, 1988, v. 56. р. 954—

960.

Мс СагдеП В.А, е,а. Isolation and characterization of à cytolysin produced by Vibrio

cholerae sегоgroup non-01.— Can. J.

Mlcrobiol., 1985, ч. 31, р, 711 — 720, (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ИВRIO CHOLERAE

01 ELTOR — ЭТАЛОН ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОЛИЗИНА (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии, касается

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии, касается штамма бактерий, служащего эталоном для получения цитолизина, и может найти применение при изучении механизма действия цитолизина на мембоаны клеток и клеточные культуры, в роли цитолизина в патогенезе заболевания, при этом цитолиэин может использоваться при создании диагностических препаратов, получении гибридом, продуцирующих антитела к этому токсину, а также при решении вопросов таксономии холерных вибрионов, Известен штамм бактерий Vibrio

metschnikovii, способный продуцировать

„„5U,, 1724690 А1 (si)s С 12 N 15/01, 1/20 // (С 12 N 1/20, С 12 R 1:63) штамма бактерий, служащего эталоном для получения цитолизина, и может найти применение при изучении механизма действия цитолизина на мембраны клеток и клеточные культуры, роли цитолизина в патогенезе заболевания. Цитолизин может использоваться при создании диагностических препаратов, получении гибридов, продуцирующих антитела к этому токсину, а также при решении вопросов таксономии холерных вибрионов. Целью изобретения является получение штамма бактерий Vibrio

cholerae 01 eltor КМ 169, используемого в качестве эталона для получения очищенного препарата биологически активного цитолизина. Из штамма выделен цитолиэин, имеющий молекулярную массу 60 кДа, изоэлектрическую точку 6,7 и обладающий выраженной цитолитической, энтеропатогенной, летальной, отекогенной активностью. 2 ил. биологически активный цитолизин, но он относится к другому виду.

Известен штамм бактерий V. cholerae поп-01 2194 с, продуцирующий цитолиэин.

Последний является белком с мол.м. 52711 и иэоэлектрической точкой (р1) 8,65, Данный цитолизин лизирует эритроциты кролика, клеточные культуры У-1 и СНО, вызывает накопление жидкости в лигированной петле кролика в дозе 600 мкг.

Однако известный штамм относится к другой серологической группе (по соматическому 0-антигену). Продуцируемый им цитолизин отличается от, полученного цитолизина по молекулярной массе и иэо1724690 электрической точке, а также слабо выраженной биологической активностью, Целью изобретения является получение штамма бактерий Vibrio cholerae 01 eltor KM

169, используемого в качестве эталона для получения очищенного препарата биологически активного цитолизина.

Штамм получен из мизид, отловленных в районе спасательной станции северного побережья Капчагайского водохранилища, путем секции по 01-антигену при помощи

01-холерной сыворотки.

Оптимальные условия хранения — в лиофилизированном состоянии при 4"С.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки.

На жидких и плотных питательных средах дает типичный рост, характерный для вибрионов; в поле фазово-контрастного микроскопа типичная для вибрионов морфология микробных клеток с характерной для этого микроба подвижностью.

Физиолого-биохимические признаки.

Реакция на индофенолоксидазу положительна, расщепляет глюкозу в аэробных и анаэробных условиях, обладает лизин- и орнитиндекарбоксилазой, не обладает аргининдегидролазой, образует индол и сероводород, разжижает желатину, обладает лецитиназной активностью, расщепляет без газа маннозу, сахарозу, маннит и инозит, не разлагает лактозу и арабинозу, дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, лизирует эритроциты овцы в пробе по

Грейгу (30 мин при 37 С), агглютинирует эритроциты курицы.

Отношение к холерным диагностическим сывороткам — агглютинируется 0-холерной сывороткой до титра, сывороткой

Инаба до титра, не агглютинируется сывороткой Огава.

Отношение к холерным диагностическим фагам (ХДФ): чувствителен к фагу Эль

Тор и не лизируется фагом С, лизируется фагом ХДФз и не чувствителен к ХДФ 4,в, относится к 10-му фаготипу по Дрожевкиной-Арутюнову. Питательные потребности — прототроф.

Генетические особенности; чувствителен к тетрациклину (M3K-0,015 мкг/мл), растет на 50 ед,/мл полимиксина.

На фиг.1 и 2 приведены кривые распределения при исследовании нового штамма.

Пример 1. Получение и очистка цитолизина.

Штамм выращивают при 37 С в течение

18 ч на агаре Мартена. Из выросших колоний готовят суспензию в 0,15 M растворе

После автоклавирования при 120 С в течение 15 мин добавляют З (об/об) стерильного глицерина.

Культивирование проводят в плоских флаконах емкостью 1 л (в каждый флакон вносят 200 мл среды) при 37 С в течение 48 ч без встряхивания. После добавления мертиолата натрия до концентрации 0,02;(, и экспозиции в течение 20 ч культуральную жидкость освобождают от клеток центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин.

Извлечение гемолитически активного белка из стерильного культурального супернатанта производят путем добавления сухого сульфата аммония до 50 насыщения при 4 С. Смесь перемешивают до полного растворения соли и центрифугируют при 10 тыс. g в течение 30 мин. Осадок суспендируют в 20 мМ трис-HCI буфере с 1 мМ ЕДТА, рН 7,6(ТЕ-буфер). Освобождение препарата от сульфата аммония осуществляют путем диализа против.20 объемов TE-буфера в течение 18 ч. Полученный на предыдущем этапе препарат наносят на колонку размером

50 х 15 мм с ДЕ-52, уравновешенную ТЕ-буфером. Элюцию проводят буфером ТЕ с 200.

MM NaCI. Для концентрирования активного белка используют преципитацию сульфатом аммония (50 .насыщения), Полученный после центрифугирования при 10 тыс. д в течение 30 мин осадок растворяют в ТЕ-буфере и освобождаются от (NH<)2$04 на колонке (1,6 х 40 см) с SephadexG-25, уравновешенной буфером 20 мМ трис-HCI, 1 MM EDTA, 0,14 М йаО, рН 7,6 (TEN-буфер).

Полученную на предыдущем этапе фракцию наносят на колонку с ультрагелем

АсА-44, уравновешенную буфером ТЕ (2,5 х х100 см). Типичный профиль элюции представлен на фиг.1 (по оси абсцисс — номера фракций; по оси ординат: t — оптическая плотность фракций в Относительных единицах (ОЕ), а II — удельная гемолитическая активность (ГЕ/мл); сплошная линия— поглощение фракций при 280 нм, линия с кружками — гемолитическая активность фракций).

Активный белок элюируется в объеме, соответствующем элюции белков с мол. массой 60+ 3 кДа. Далее препарат наносят на колонку 0,5 х 5 см MonoQ, уравновешенную

NaCI с концентрацией микробных к .еток 1 млрд/мл колониеобразующих единиц (КОЕ). Суспензию используют в качестве по. севного материала, который вносят из расчета 1 млрд КОЕ на 100 мл среды в модифицированную среду 0avis следующего состава, г/л: К2НР04 7,0; КНгРО4 2,0; (МНа)2$04 1,0; цитрат натрия 0,5; Mg$04.

° 7НрО 0,1; дистиллированная вода — до 1 л, 172nr>90

0,7

0.5 о.s о.э

0.2 ол

TEN-буфером, Адсорбировавшийся материал элюируют тем же буфером с линейным градиентом концентрации NaCI от 140 до

800 мМ. Как следует из кривой распределения (фи1.2,по оси абсцисс — номера фрак- 5 ций; по оси ординат: I — оптическая плотность фракции в ОЕ; II — удельная гемолитическая активность фракции (ГЕ/мл), .III — концентрация NaCI (М); сплошная линия— поглощение фракций при 280 нм, линия с 10 кружками — гемолитическая активность фракций (ГЕ /мл),.пунктирная линия — градиент NaCI), активный белок элюируется при концентрации NaCI 750 мМ. Эти фракции объединяют и переводят в ТЕМ-буфер на 15 колонке PD-10 с Сефадексом G-25 (степень очистки препарата — 256 раз).

По данным SDS-диск-электрофореза полученный препарат содержит 1 компонент молекулярной массы около 60000, изо- 20 электрическая точка препарата 6,7.

Пример 2. Определение цитолитической активности цитолизина на модели перевиваемой линии клеток 1-929 (фибробласты мыши). В опыт берут моно- 25 слой клеток, культивированных в 95-луночных плоскодонных микропланшетах

"0пЬго" в 0.1 мл среды 199 с 10 сыворотки крупного рогатого скота при 37 С и повышенном содержании СОг. 30

В первую лунку вносят 100 мкл среды

199 с содержанием 2,2 мкг очищенного ток сина и титруют в 14 лунках. Учет резулы этов проводят через 18 ч. Цитоксический зффек . проявляется в виде разрушения монослоч, округления клеток с последующим пикно зом. Одна цитотоксическая единица составляет 21 нг/мл токсина. Ци голизин оказывает также цитотоксическое действие на клеточные линии Vего, HF p-2, L-41, МОСК, ВНК-21.

Цитолитическая активность цитолизинэ полностью исчезает после нагревания при

56 С в течение 30 мин и нейтрализуется антисывороткой к очищенному препарату.

Пример 3. Определение энтеропэтогенного действия цитолизина.

Кроликам-сосункам вводят внутрикишечно 70 мкг очищенного препарата в 0,3 мл

TNB-буфера (трис-HCI 20 мМ; NaCI 140 мМ;

BSA 170; рН 7,6), Через 7 ч животных вскрывают. Отмечаются следующие патологические изменения: значительное увеличение размеров желудка, инъекция сосудов тонкого кишечника и брыжейки, накопление слизистой жидкости в тонком кишечнике. атония толстого кишечника и накопление в нем жидкости желто-зеленого цвета.

Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae 01 elisor.

КМ169 — эталон для получения цитолизинэ.

1724690

Составитель Л. Минеева

Техред М,Моргентал Корректор С. Черни

Редактор И, Дербак

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 1150 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5