Способ определения биологической активности сульфаниламидов

 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии. Цель - повышение точности определения. С этой целью после введения исследуемого препарата экспериментальному животному осуществляют забор 0,075-0.15 мл крови, выявляют медленный и быстрый ацетилярный прототип и при превышении концентрации препарата у медленных ацетиляторов по сравнению с быстрыми на 23% и более определяют биологическую активность фаниламида. Применение способа позволяет повысить точность определения биологической активности сульфатилэмидов на 30% по сравнению с прототипом.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕН<ЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4720992/14 (22) 24,07.89 (46) 07.01.92. Бюл, 1Ф 1 (71) Ленинградский научно-исследовательский институт детских инфекций (72) Л.Н, Буловская, Г.Н.Борисенко и Л.М.Косенко (53) 615.475 (088.8) (56) Jamarakl М. et at. Chemical andpharmacologlcal Bulletin. 1968, ч. 16, 4, р.

721-727. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СУЛЬФАНИЛАМИДОВ

Изобретение относится к медицине, а именно, к фармакологии.

Цель изобретения — повышение точности и определения.

Способ осуществляют следующим образом.

Выясняют тип ацетилирования у обследуемой группы кроликов с помощью нагрузки сульфадимезином. Готовят раствор сульфадимезина 0,5 г и в 100 мл дистиллированной воды (0,018 М раствор). Взвешивают 500 мг сульфадимезина переносят в колбу на 100 мл, добавляют небольшое количество дистиллированной воды, перемешивают, для полной растворимости добавляют по каплям 1,0 н. и 0,1 н. раствор щелочи NaOH и после растворения сульфадимезина раствор нейтрализуют до рН 7,07,5 1,0 н. и 0,1 н. раствором соляной кислоты. Объем доводят до 100 Мп дистиллированной водой.

„„5U„„17О4152А1 (я)з G 09 В 23/28, G 01 N 33/48

/ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии. Цель — повышение точности определения. С этой целью после введения исследуемого препарата экспериментальному животному осуществляют забор 0,075-0 ° 15 мл крови, выявляют медленный и быстрый ацетилярный прототип и при превышении концентрации препарата у медленных ацетиляторов по сравнению с быстрыми на 23 и более определяют биологическую активность сульфаниламида. Применение способа позволяет повысить точность определения биологической активности сульфатиламидов на 30 по сравнению с прототипом.

Перед обследованием кролика взвешивают. Раствор сульфадимезина 0,50 г/100 мл вводят внутрибрюшинно с учетом веса животного 20 мг на 1 кг (4 мл раствора).

Через 1 ч после введения сульфадимезина берут кровь иэ ушной краевой вены уха в количестве нескольких капель (0.075-0,15 мл) на фильтровальную бумагу в квадрат размером 25х25 мм. Кровь должна пропитывать фильтровальную бумагу. После этого кровь высушивают на воздухе при комнатной температуре. Непосредственно перед определением вырезают квадрат 25х25 мм, содержащий высушенную пробу. Измельчают его ножницами, помещают в центрифужную пробирку, добавляют 0,5 мл 20;ь-ного раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белков, тщательно перемешивают стеклянной палочкой, добавляют 1,5 мл дистиллированной воды. Проба стоит 15-20 мин, в течение которых ее несколько раэ перемешивают для полного извлечения

1704152 ацетон;лированного находят по разнице меж-, 50

55 сульфадимезина в раствор. Далее пробу центрифугируют 20-30 мин при 3000 об,/мин, Полученный центрифугат разливают по 0,5 мл в две пробирки с размером внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм. K 0,5 мл центрифугата в каждую из двух пробирок прибавляют по 0,1 мл 4 н.соляной кислоты, перемешивают встряхиванием.

Одну из двух пробирок плотно закрывают фольгой и ставят гидролиэоваться на 45 мин и кипящую водяную баню (100ОС).

В гидролизованной пробе определяют общий сульфадимизин, т.е. ацетилированный и свободный вместе, а в пробе, которую не подвергают гидролизу — свободный сульфадимезин. Далее обе пробы гидролизованную и негидролизованную ставят в холодильник при 4 С на ЗО мин. Сразу после охлаждения в холодильнике в обе пробирки приливают по 0,1 мл 0,2 (-ного азотистокислого натрия (раствор должен быть свежеприготовленным, т.е. готовят в период, когда пробы находятся в холодильнике).

Пробы перемешивают встряхиванием и точно через 4 мин приливают по 0,1 мл 1,0 ного раствора аммония сульфаминовокислого, встряхивают. Через

2 мин приливают 0,2 мл 0,017-ного раствора Й-(1)-нафтилэтиле ндиаминдигидрохлорида. Пробы помещают в темноту на 1 ч и через каждые 15 мин встряхивают для удаления пузырьков газа. Наблюдают розовое окрашивание раствора, оптическую плотность которого определяют на микрофотоколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно

"холостого" опыта, которы ставят параллельно гидролизованной и негидролиэованной пробам. но в котором экстрагировали измельченный квадрат чистой фильтровальной бумаги размером 25х25 см. Количество сульфадимезина определяют по калибровочной кривой (мкмоль).

В гидролизованной пробе определяют количество общего сульфадимезина (ацетилированный сульфадимезин плюс свободный сульфадимезин). В негидролизованной пробе определяют только свободный неацетилированный сульфадимезин. Количество ду общим сульфадимезином и свободным.

Активность ацетилирования выражают процентным отношением ацетилированного сульфадимезина к общему его количеству.

Если определенный процент ацетилирования ниже 50 . то обследуемый кролик с медленным типом ацетилирования, если выше 501ь то с быстрым типом ацетилирования. Таким образом отбирают группу животных, включающую медленных и быстрых

45 ацетиляторов для определения биологической активности исследуемого препарата.

Сульфадимезин, применяемый для фенотипирования, у отобранной группы кроликов с медленным и быстрым типом ацетилирования удаляется иэ организма в течение 1-2 сут и по истечении этого срока кроликов пользуют для определения биологической активности исследуемого препа= рата.

Испытуемый сульфаниламидный препарат в дозе, эквимолярной сульфадимезину, т.е. 0,072 ммоль нв 1 кг, вводят внутрибрюшинно и через 1 ч берут кровь из ушной краевой вены в сухую центрифужную пробирку. Кровь центрифугируют при 3000 об./мин 100 мин. В сыворотке определяют концентрацию свободной активной формы испытуемого препарата. 8 центрифужную пробирку, содержащую 0,5 мл 20 -ного

ТХУ, добавляют 0,1 мл сыворотки и 1,4 мл дистиллированной воды до объема 2,0 мл.

Через 5 мин пробу центрифугируют 30 мин при 3000 об./мин. Полученный центрифугат используют для определения концентраций активной свободной формы препарата. Для этого к 0,5 мл центрифугата приливают 0,1 мл 4 н.НО. После охлаждения в холодильнике к пробе добавляют 0,1 мл 0,2ф,-ного

Кайо (свежеприготовленного), пробу встряхивают и через 4 мин добавляют 0,1 мл

1,0 -ного аммония сульфаминовокислого, снова перемешивают встряхиванием. Через

2 мин в пробы приливают 0,2 мл 0,01 -ного

N-(1)-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида.

Пробу помещают в темноту на 1 ч. в течение которого через каждые 15 мин ее встряхивают для удаления пузырьков газа, Оптическую плотность раствора измеряют при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см против "холостого" опыта, постановка которого аналогична и параллельна пробе, но вместо исследуемого материала, т.е, и вместо 0,1 мл сыворотки, добавляют

0,1 мл дистиллированной воды.

Концентрацию (в мкмоль/л) исследуемого сульфаниламидного препарата в его активной свободной форме находят по калибровочной кривой, построенной для данного препарата. Вычисляют среднюю величину концентрации свободной формы и ее среднюю ошибку. отдельно в обследуемой группе с медленным ацетиляторным фенотипом и отдельно -с быстрым ацетиляторным фенотипом. Вычисляют достоверность различия средних величин концентраций активной формы сульфаниламида в сыворотке соответственно у медленных и быстрых ацетиляторов.

1704152

В случае если концентрация препарата превышает у медленных ацетиляторов соответствующий показатель у быстрых ацетиляторов на 23 и более определяют биологическую активность исследуемого препарата.

Пример 1. 20 взрослым беспородным кроликам вводили раствор сульфадимезина

0,50 г/100 мл внутрибрюшинно с учетом веса животных 0,072 ммоль на 1 кг. Через 1 ч порле введения сульфадимезина берут кровь иэ ушной краевой вены уха в количестве нескольких капель на фильтровальную бумагу в квадрат размером 25х25 мм в объеме 0,075 мл. После этого кровь на бумажках высушивают на воздухе при комнатной температуре.

Перед употреблением вырезают квадрат 25х25 мм, содержащий высушенную пробу и измельчают его ножницами. помещают в центрифужную пробирку. К пробе добавляют 0,5 мл 20 -ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и добавляют 1,5 мл дистиллированной воды. Пробы стоят 15-20 мин, ее несколько раз перемешивают, Далее пробу центрифугируют 20-30 мин при

3000 об./мин. Центрифугат разливают по

0,5 мл в две пробирки размером внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм. К 0,5 мл центрифугатв в каждую из двух пробирок прибавляют по 0,1 мл 4 í.HCI, перемешивают встряхиванием, Одну из двух пробирок плотно закрывают фольгой и ставят гидролизоваться на 45 мин в кипящую водяную баню (100 С). В гидролизоеаннсй пробе определяют общий сульфадимезин, т.е. ацетилирсванный и свободный вместе, а в пробе, которую не псдвер"ают гидрсл»эу— свободный сульфадимезин. Далее обе пробы гидролизованную и негидрслизсванную, ставят в холодильник при 4 С на 30 мин.

Сразу после охлаждения в холодильнике в обе пробы приливают по 0,1 мл 0,2 -ного аэстистокислого натрия Май02 (раствор

NaN02 должен быть свежепригстселенным т.е, готовят в период, когда пробы находятся в холодильнике). Пробы перемешивают. встряхиванием и точно через 4 мин приливают по 0,1 мл 1,0 -ного раствора аммония сульфаминовокислсго, встряхивают. Через

2 мин приливают 0,2 мл 0,01 -ного раствора N (1)-нафтилэтилендиами ндигидрсхлорида. Пробы помещают е темноту на 1 ч через каждые 25 мин встряхивают для удаления пузырьков газа.

Оптическую плотность исследуемого раствора определяют на приборе микрофотоколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно

10

20

25 Из обследуемых 20 беспородных кроли30

"холостого" опыта, который ставят параллельно гидролизоеаннсй и негидролиэованной прсбач, нс ь кссрсм экстрагирсвали измельченный квадрат чистой фильтровальной бумаги размером 25х25 мм. Расчет количества сульфадимезина (мкмоль) в пробе ведут по калибровочной кривой, Определяют количество общего сульфадимезина в гидролиэованной пробе и количество свободного сульфадимезина в негидролизованной пробе. flo разнице между общим и свободным сульфадимезином находят ацетилированный сульфадимезин. Активность ацетилирования вычисляют по процентному отношению ацетилированного сульфадимезина к общему.

В результате проведенного исследования у каждого из 20 кроликов по полученному проценту ацетилирования устанавливают ацетилятсрный фенотип. Если определенный процент ацетилирсеания ниже 50, то обследуемый кролик с медленным типом ацетилирования, если выше

50ф>, то с быстрым типом ацетилироеания. ков в результате фенотипирования было выявлено 15 кроликов с быстрым типом ацетилирования, у которых средний процент ацетилирования составлял 71,7 -1,2 и

5 — с медленным типом ацетилироеания, где процент ацетилирования в среднем равнялся 32,9+4,7.

Из тестируемой группы далее отбирают

5 кроликов с медленным и 5 кролик" в с быстрым Tl .ã см ацет» »рсеаиия и через 1-2 дн ввод т внутрибрюш»ннс (натощак) испытуемый препарат норсульфазол е той же эквимслярной дозе — 0,072 ммсль на 1 кг массы тела, Через 1 s берут крсеь 0,5-1 мл иэ краевой ушной еены в центрифуж:yn пробирку. После цен; фугирсвания е сыесрстке определяют т-=,": ко кснцентс..— цию

BKTHBH0f G He»3h1 VHC с пр Tl3$3 2 f я 37сго к 0,1 мл сыворотки добавляют 0,5 мл 20 ного раствора трихлс „, ксуснсй кислоты для осаждения бе,".ксв и i,4 h.л „"лс;»,-, i рсванной есды. Общий объем 2 0 мл, Тщательно перемешивают содам:нмсе пссб»сл и проба сто»т 15-20 мин. Далее пробу ц; —; . рифугируют при 3600 сб./м»н. Отбирают 0,5 мл центрифуггта е проб»рку с раз лесом внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм. Прибавляют к центр1фугату 0,1 мл 4 н.НС!, перемешивают встряхиван»=м, Помещают пробу е холодильник 4 С на 30 мин.

Сразу после охлаждения приливают 0.1 мл

0,2 -ного аэстистскислсго натрия NaNO2 (свежепригстсвленнсгс,. После каждого добавления реактивов содержимое проб»рок

1, 04152 тщательно перемешивают встряхиванием.

Через 4 мин 0,1 мл 1,0 -ного раствора аммония сульфаминовокислого, через 2 мин—

0,2 мл 0,01 -ного раствора й-(1)-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида. Пробу помещают в темноту на 1 ч и через каждые 15 мин встряхивают для удаления пузырьков газа, Оптическую плотность измеряют на приборе микрофотоколориметре при длине волны

540 нм в к оветах с толщиной слоя 1 см относительно "холостого" опыта, который ставят параллельно с пробой, добавляя вместо сыворотки 0,1 мл дистиллированной воды, Расчет концентрации активной свободной формы норсульфазола ведут по калибровочной кривой. построенной для данного препарата.

В результате были получены следующие значения концентраций для свободной формы норсульфазола у 5 медленных кроликов, мкмоль/л: 253, 234, 300, 157. 253, что в среднем составляет 239+28, а у животных с быстрым типом ацетилирования: 110, 120, 68, 131, 151, в среднем 117+ 7. Далее оценивают различия по критерию Стъюдента. При данном количестве случаев р а 0,01 (т.,е. меньше 0,05), Таким образом, при одинаковой дозировке норсульфазола концентрация его активной свободной формы будет выше у медленных ацетиляторов, в данном случае

239 мкмоль/л, чем у быстрых ацетиляторов

117 мкмоль/л на 1047, т.е. определена биологическая активность препарата.

Для подтверждения повышения точности предлагаемого способа по сравнению с известным была определена концентрация активной формы препарата норсульфазола у этих же 20 беспородных кроликов без предварительного фелотип :рсвания. E среднем концентрация норсульфазола составляла 142 -16 мкмоль/л.

Таким образом, среднее значение к" нцентрации свободной активной формы препарата по известному способу 142 16 мкмоль/л на самом деле складывается из значительно более высокой концентрации испытуемого препарата у медленных ацетиляторов 299+28 мкмоль/л, т.е. точность при сравнении с известным способом для медленных ацетиляторов повысилась на 68, и более низкой концентрация у быстрых ацетиляторов 117ч 17 мкмоль/л.

Пример 2. 20 взрослым беспородным кроликам вводили раствор сульфадимезича

0,50 г/100 мл внутрибрюшинно с учетом веса животных 0,072 ммоль на 1 кг. Через 1ч после введения сульфадимезина берут кровь из ушной краевой вены уха в количе5

4г

55 стве нескольких капель (0,15 мл) на фильтровэльную бумагу в квадрат раал;ером 25х25 мм. После этого кровь на 6 ма ках высушивают на воздухе при комнатнсй температуре.

Перед употреблением вырезают квадрат 25х25 мм, содержащий высушенную пробу и измельчают его ножницами, помещают в центрифужную пробирку. К пробе добавляют 0,5 мл 20 -ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и добавляют 1,5 мл дистиллированной воды. Проба стоит 15-20 мин, ее несколько раэ перемешивают. Далее пробу центрифугируют 20-30 мин при

3000 об./мин. Центрифугат разливают по

0,5 мл в две пробирки размером внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм. К 0,5 мл центрифугата в каждую иэ двух пробирок прибавляют по 0,1 мл 4 н,HCI, перемешивают встряхиванием. Одну из двух пробирок плотно закрывают фольгой и ставят гидролизоваться на 45 мин в кипящую водяную баню (100 С). B гидролиэованной-пробе определяют общий сульфадимезин, т.е. ацетилированный и свободный вместе, а в пробе, которую не подвергают гидролизу — свободный сульфадимезин.

Далее обе пробы, гидролизованную и негидролизованну)о. ставят в холодильник при 40 С на 30 мин. Сразу после охлаждения в холодильнике в обе пробы приливают по 0,1 мл 0,2 $-ного аэотистокислого натрия

NaNOz (раствор NaN02 должен быть свежеприготовленным, т.е. готовят в период, когда пробы находятся в холодильнике). Пробы перемешивают встряхиванием и точно через 4 мин приливают по 0,1 мл 1,0 -ного раствооа аммония сульфаминовокислого, встряхивают, Через 2 мин приливают 0,2 мл

0,01 -ного раствора N (1)-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида, Пробы помещают в темноту на 1 ч ереэ каждые 25 мин встряхивают для удаления пузырьков газа. Оптическую плотность исследуемого раствора определяют на приборе микрофотоколориметре МКМФ-1 при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно

"холостого" опыта, который ставят параллельно гидро "изсванной и негидролизованной пробам. но в котором экстрагировали измельченный квадрат чистой фильтровальной бумаги размером 25х25 мм. Расчет количества сульфадимезина (мкь;оль) в пробе ведут по калибровочной кривой. Определяют количество общего сульфадимезина в гидролизованной пробе и количество свободного сульфадимезина — в негидролизованной пробе. По разнице между общим и

1704152

10 свободным сульфадимезином находят ацетилированный сульфадимезин.

Активность ацетилирования вычисляют по процентному отношению ацетилированного сульфадимезина к общему.

В результате проведенного исследования у каждого из 20 кроликов по полученному проценту ацетилирования устанавливают ацетиляторный фенотип. Если определенный процент ацетилирования ниже 50, то обследуемый кролик с медлен ным типом ацетилирования, если выше

50ф, то с быстрым типом ацетилирования.

Иэ обследуемых 20 беспородных кроликов в результате фенотинирования было выявлено 10 кроликов с быстрым типом ацетилирования, у которых средний процент ацетилирования составлял 71,7е1,2 и

10 — с медленным типом ацетилирования, где процент ацетилирования в среднем равнялся 32,9Q,7. Иэ тестируемой группы далее отбирают 5 кроликов с медленным и 5 кроликов с быстрым типом ацетилирования и через 1-2 дн вводят внутрибрюшинно (натощак) испытуемый препарат белый стрептоцид в той же эквимолярной дозе 0,072 ммоль на 1 кг массы тела. Через 1 ч берут кровь 0,15 мл из краевой ушной вены в центрифужную пробирку. После центрифугирования в сыворотке определяют только концентрацию активного неизменного препарата. Для этого к 0,1 мл сыворотки добавляют 0,5 мл 207,-ного раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белков и 1,4 мл дистиллированной воды.

Общий объем 2,0 мл. Тщательно перемешивают содержимое пробирки и проба стоит

15-20 мин, Далее пробу центрифугируют при 3000 об./мин. Отбирают 0,5 мл центрифугата в пробирку с размером внутреннего диаметра

10 мм и высотой 120 мм. Прибавляют к центрифугату 0,1 мл 4 í.HCI, перемешивают встряхиванием. Помещают пробу в холодильник при 4 С на 30 мин. Сразу после охлаждения приливают 0,1 мл 0,2ф,-ного азотистокислого натрия NaNOz (свежеприготовленного). После каждого добавления реактивов содержимое пробирок тщательно перемешивают встряхиванием. Через 4 мин 0,1 мл 1,0 -ного раствора аммония сульфаминовокислого, через 2 мин — 0,2 мл

0,01 -ного раствора й-(1)-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида. Пробу помещают в темноту на 1 ч и через каждые 15 мин встряхивают для удаления пузырьков газа. Оптическую плотность измеряют на приборе микрофотоколориметре при длине волны

540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно "холостого опыта, который ставят параллельно с пробой, добавляя вместо сыворотки 0,1 мл дистиллированной воды.

В сыворотке крови, определяли концентрацию активного свободного белого стрептоцида в мкмоль/л, которая у медленных кроликов была: 105, 103, 105, 217, 181 — в среднем 142 22, а у быстрых 158, 89, 173, 165, 110 — в среднем 139116, т.е. не превышает 30 . Таким образом, концентрация свободного белого стрептоцида в крови при одинаковой дозировке не различается у медленных и быстрых ацетиляторов.

Концентрация свободного активного белого стрептоцида у 20 беспородных кроликов составила по известному способу14210 мкмоль/л.

Таким образом, белый стрептоцид инактивируется в организме мономорфной системой ацетилирования и можно не учитывать его тип ацетилирования, как при применении этого препарата для изучения биологической активности, так и для лечения.

Применение предлагаемого способа позволяет повысить точность определения биологической активности сульфаниламидов на 30 (, по сравнению с известным, Формула изобретения

Способ определения биологической активности сульфаниламидов путем введения исследуемого препарата экспериментальному животному и определения концентрации свободных и ацетилированных форм препарата в крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения. осуществляют забор 0,075-0,15 мл крови, выявляют медленный и быстрый ацетиляторный фенотип и при превышении концентрации препарата у медленных ацетиляторов посравнениюс быстрыми на 23 и более определяют биологическую активность сульфаниламида.