Питательная среда для выращивания бактерий francisella тulаrеnsis

 

Изобретение относится к микробиологии , а именно к получению питательных сред. Целью изобретения является повышение ростовых свойств. Поставленная цель достигается тем. что в среду, содержащую 1-аргинин-НС1. L-цистеин-НС. L-гистидин- HCI. 1 -лизин-НС1. DL-изолейцин. DL-метионин. DL-треонин. L-пролин. .L-лейцин. L-валин. L-тирозин. L-серин. L-аспарагиновую кислоту, калий фосфорнокислый, однозамещенный. натрий фосфорнокислый двухзамещенный. сернокислый магний семиводный. глюкозу, агар-агар и воду, дополнительно вводят комплекс гемина с гистидином и дрожжевой экстракт. Полученная среда позволяет выращивать единичные, колонии как вакцинных, так и вирулентных штаммов. Стабильность состава и высокая химическая чистота компонентов, используемых для ее приготовления, делает возможным применение этой среды в технологии производства туляремийной вакцины. 2 табл. Ё

: . (Ил, I ", .(.l i(КИХ

l :. Е > Г, » . (.() С 12 N 1/20

l О, у,, >»l>(ТГ1Еlll,Ь(v1 К,.(Л 1 l (lO ИЗО>Г l Е (Г НИ>((»1 (l (i(ÊÃ Е, Т ЧЯМ

Г1 «4 Г л((т С(с(ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛ6СТВУ (2 1) 48004 78/1 3 (22) 06.03.90 (46) 07.01.92. Бюл. N. 1 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) П В.Бабаева. B.Ã.Ãàâðèêîâ. Л.И.Абросимова и И.В Шолохов (53) 576.8.093.3 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Nò 1013470, С 12 N 1/20. 1981.

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1969. N . 4. с, 34 — 36. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИЙ FRANCISELLA

TULARENSIS (57) Изобретение относится к микробиологии. а именно к получению питательных сред. Целью изобретения является повышение ростовых свойств. Поставленная цель

Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению питательных сред, Цель изобретения повышение ростовых своиств.

Пример 1 Питательную среду готовят поэтапно следующим образам.

Приготовление кол1плекса .емина с -истидином.

24 мг гемина добавляют к 20 мл 0 2 М раствора солянокислого гистидина (0.8 г1 в дистиллированной воде (р Н 8.0). Суспензию оставляют в темноте на магнитной мешалке при 21 С на 15 ч. пос1е чего стерилиэуют фильтрацией через нитроцеллюлозные фильтры диаметром пор 0.22 мкм.

Приготовление растворов компонентов питательной среды вносимых в основной раствор отдельно.

SU,, 1703683 А1 достигается тем. что в среду, содержащую

1-аргинин-HCI. L öèñòåèí-HCI. L-ãèñòèäèíHCI. 1-лизин-HCI. DL-изолейц(н. DL-ме ионин. DL-треонин. L-пролин. L-лейцин.

L-валин, L-тирозин, L-серин. -аспарагиновую кислоту, калий фосфорнокислый. Одно замещенный. натрий фосфорнокислый двухзамещенный, сернокислый магний семиводный. глюкозу, агар-агар и воду. дополнительно вводят комплекс гемина с гистидином и дрожжевой экстракт. Полученна среда позволяет выращивать единичные. колонии как вакцинных, так и вирулентных штаммов. Стабильность состава и высокая химическая чистота компонентов. используемых для ее приготовления, делает возможным применение этой среды в технологии производства туляремийной вакцины. 2 табл.

Раствор дрожжевого экстракта.

К 15 г дрожжевого экстракта осторо:кно добавляют 70 мл дистиллированной воды и добиваются полного растворения при гостоянном перел1ешивании. после чего доводят объем до 100 M> дистиллированной водой.

Раствор глюкозы.

К 100 мл теплой дистиллированной воды присыпают 50 г глюкозы и перемеш((вают до полного растворения.

Приготовление основных растворов для получения плотной синтетической питат(льной среды.

Приготовление К-N a-фосфат ного буф(ра.

На 1 л берут 1.5 г двузал1ещенного (1>осфорнокислого натрия (МаЗНРОч) и 2.6 г однозамещенного фосфорнокислого калия (КСНР04). растворяют отдельно в 300 л1л ди1703683

20 стиллированной воды и, нагревая растворы до 70 С, добиваются полного растворения солей, после чего растворы сливают, охлаждают до комнатной температуры, доводят рН до 7,2-7,3 и добавляют дистиллирован- 5 ную воду до 1 л, Для получения плотной синтетической среды разделяют К-Na-фосфатный буфер на две части по 500 мл и к одной из них добавляют 10 г агар-агара (раствор А). 10

Оставшуюся часть К-Na-фосфатного буфера используют для растворения аминокислот и солей, получая раствор Б.

Готовят следующие навески, г: ! -аргинин-НС! 0,15 15 ! -гистидин-НС! 1,8

L-цистеин-Н С! 1,3 ! -лизин-НС! 0,35

D,L-изолейцин 0,2

О, L-мети он и н 0,45

D,L-треонин 2,0

L-пролин 0,9

L-лейцин 0,2 ! -валин 0,75 ! -тирозин 0,15 25

L-сорин 0,1

L-аспарагиновая кислота 0,1

Na CI 4,5

Mg5О 7HzO 0,04

Каждую из аминокислот растворяют по- 30 следовательно в 20 мл буфера. нагревают до

90 С, перемешивая до полного растворения. Для лучшего растворения к растворам лейцина, изолейцина и цистеина добавляют по 1 мл 1 М раствора HCI, а к растворам 35 теронина и тирозина по 1 мл 1 М раствора

NaOH.

Навески хлористого натрия и сернокислого магния растворяют вместе в 50 мл KNa-фосфатного буфера. Полученные 40 растворы аминокислот и солей сливают в одну емкость, доводят объем остатками KNa-фосфатного буфера до 0.5 л (раствор Б) и стерилизуют в автоклаве с отдельно приготовленными растворами дрожжевого экс- 45 тракта и глюкозы 20 мин при 110 С и давлении 0,5 атм.

Раствор А расплавляют на кипящей водяной бане (100 С) в течение 20 мин, После стерилизации и охлаждения к 50 раствору Б асептически добавляют 5 мл комплекса гемина с гистидином; 30 мл 15 — ного раствора дрожжевого экстракта; 28 мл

50 -ного раствора глюкозы.

В случае необходимости стерильно до- 55 водят рН полученной среды до 7,0-7,2, используя 0,1 М растворы HCI или NaOH.

Осторожно вливают подогретый до 45 С раствор Б с внесенными добавками в емкость с расплавленным агаром (раствор А) и разливают полученную плотную среду s чашки Петри по 25-30 мл.

Разлитые чашки со средой, а также комплекс гемина с гистидином, растворы дрожжевого экстракта и глюкозы можно хранить при 4 С д 60 сут (время испытания).

Хранение растворов А и Б возможно, но в этом случае необходимо внесение свежеприготовленного раствора цистеина в раствор Б. Для этих целей исключают

HCI-цистеин из состава заренее приготовляемого раствора Б и готовят 10 -ный раствор солянокислого цистеина, стерилизуя его автоклавированием при 110 С и давлении 0,5 атм в течение 20 мин. Обычно берут

5 г солянокислого цистеина и растворяют его в 50 мл дистиллированной воды. Иэ стерильного 10 -ного раствора цистеина вносят асептически в стерильный раствор Б

13-17 мл непосредственно перед разливом среды.

Пример 2. Готовят питательную среду аналогично описанию в примере 1, используя при этом следующие навески компонентов, г;

К-Na-фосфатный буфер

КН2Р04 3,1

Na2HPOq 1,8

Раствор А:

Агар-агар 15,0

Раствор Б !

=аргинин-H CI 0,25

L-гистидин-H CI 1,2

L-цистеин-H CI 1,7 ! -лизин-НС! 0,45

D,L-изолейцин 0,4

D,L-метионин 0,55

D,L- peo 4,0

L-пролин 1,1

L-лейцин 0,4

L-валин 0.85 ! -тирозин 0,25

L-серин 0,3

L-аспарагиновая кислота 0,3

NaCI 5,5

MgSO4 7Н20 0.05

К проавтоклавированному раствору Б стерильно добавляют 20 мл комплекса гемина с гистидином; 5 мл 15 -ного раствора дрожжевого экстракта; 32 мл 50 -ного раствора глюкозы.

Пример 3. Микробиологические испытания плотной питательной среды, описанной в примерах 1 и 2, проводились с использованием в качестве тест-штаммов

Ег tularensls вакцинного штамма 15/3 (Гайского) и вирулентного штамма голарктической разновидности N 503. Контрольными средами сравнения служили среда Майского и соавт„а также среда Кундина на

1703683 основе arapa "Д" со щелочным раствором

"чг рного альбумина", как одна из наиболее чувствительных питательных сред, известных в настоящее время.

Испытания включают определение: а) чувствительности (способности среды обеспечивать рост микроба иэ минимальных посевных доз); б) скорости роста (времени появления типичных колоний); в) показателей прорастания (процентное отношение числа сформировавшихся колоний на испытуемой среде к числу таковых на контроле).

Для подготовки испытаний штаммы, хранившиеся в лиофилизированном состоянии, дважды пересевались на среду МакКоя и инкубировались при 37 С в течение

48 ч, Взвесь микробных клеток готовят, используя стандарт мутности на 10 ед, ГИСК им, Л,А.Тарасевича, последовательными 10кратными разведениями до 500 и 50 клеток в 1 мл. Каждую посевную дозу высевают по

0,1 мл на 5 агаровых пластин с вариантами сред примеров 1 и 2, а также с контрольными средами, Инкубируют при 37 С в течение

3 сут.

Результаты исследований приведены в табл. 1 и 2.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в отличие от среды Майского на предложенной среде удалось добиться удовлетворительного роста вакцинного и вирулентного штаммов Рг tularensis, сходного по количественным показателям со средой Кундина, Колонии штамма 15/3 появлялись на разработанной среде уже через 48 ч культи5

50 вирования и достигали максимальных размеров через 72 ч, в то время как колонии штамма 503 появлялись несколько позднее (через 72 ч) и достигали максимальных раэмеррв через 96 ч. Изолированная колония достигает 1,0-2,5 мм в диаметре, по форме округлая, выпуклая, прозрачная с сероватоголубоватым оттенком.

Таким образом, предлагаемая плотная питательная среда может найти широкое применение для подсчета жизнеспособных клеток, при выделении чистых культур, определении питательных пот «бностей как известных ранее, так и вновь выделяемых штаммов туляремийного микроба. Стабильность состава и высокая химическая чистота компонентов, используемых для ее приготовления, делает возможным применение этой среды в технологии производства туляремийной вакцины.

5 — 20 мл

До 1 л

Формула изобретения

Питательная среда для выращивания бактерий Francisella tularensis, содержащая солянокислый L-аргинин, солянокислый

L-цистеин, солянокислый L-гистидин, солянокислый L-лизин, D,L-иэолейцин, D,Lметионин, D,L-треонин, L-пролин, L-лейцин.

L-валин, L-тирозин, 1=серин, L-аспарагиновую кислоту, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий хлористый, магний сернокислый семиводный, глюкозу, агар-агар и дистиллированную воду, о т л ич а ю щ а я с я тем, что, с целью повышения ростовых свойств, она дополнительно содержит комплекс гемина с гистидином и дрожжевой экстракт при следующем количественном соотношении компонентов, г/л;

Солянокислый L-аргинин 0,15-0.25

Солянокислый L-гистидин 1,2-1,8

Солянокислый L-цистеин 1,3-1,7

Солянокислый L-лизин 0,35-0,45

D,L-изолейцин 0,2-0,4

D,l -метионин 0,45 — 0,55

ОЛ -треонин 2,0-4,0

L-пролин 0.9-1.1

1=лейцин 0,2-0,4

1-валин 0,75 — 0,85

L-тирозин 0,15 — 0,25

L-cep 0,1 — 0,3

L-аспарагиновую кислоту 0.1-0,3

Калий фосфорнокислый однозамещенный 2,6-3,1

Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 1,5-1,8

Натрий хлористый 4,5-5,5

Магний сернокислый семиводный 0.04-0.05

Глюкоза 14,0-16,0

Дрожжевой экстракт 0,75-3,0

Агар-агар 10,00 — 15.00

Комплекс гемина с гистидином

Дистиллированная вода

1703683

Таблица 1

Среда Кундина спл,рост

38+7

4+0,2 спл.рост

46 4

4+0,6

Таблица 2

Сравнительные данные показателей прорастания и темпов роста питательных сред ер колоний, 503

Редактор Л. Волкова

Заказ 40 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Биологические свойства питательных сред для культивирования туляремийного микроба

Составитель А. Федоров

Техред М.Моргентал Корректор Т. Малец

72 «-7

0,5-1.5

74 4

0,5-1,5

85 -11 н ичн ые KoiIQ и отсутств.

74+5

0,7 — 1,0