Способ определения функциональной активности т-лимфоцитов- супрессоров

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

RO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 4

О

М

Сд о (21) 4664988/14 (22) 22.03.89 (46) 30.12.91, Бюл. N 48 (71) Донецкий государственный медицинский институт им.М.Горького (72) А.M. Гнилорыбов, В.В. Синяченко, В.Н.

Сокрут, А.Н. Агеев и А.А. Заплотная (53) 615.375(088.8) (56) Петров Р,В„Лебедев К.А., Симонова

А.В, Физиология человека. — 1986, т.12, N. 1, с.94 — 99. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ Т-ЛИМФОЦИТОВ-СУПРЕССОРОВ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности Т-супрессоров и определения показаний к лечению больных средствами иммуномодулирующего действия.-Целью изобретения является сокращение времени и повышение точности исследования. Поставленная цель достигается тем, что реакцию розеткообразования с эритроцитами барана ставят параллельно в 2 пробах с лимфоцитами, интактными и предварительно инкубированными в течение 40 — 42 мин с теофиллином. ПодсчитываИзобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности Т-лимфоцитов-супрессоров и выработки показаний к лечению больных.

Целью изобретения является сокращение времени и повышение точности определения.

„„ Ы„, 170231б А1 ют розеткообразующие лимфоциты в мазках обеих проб с одновременным определениемм количества гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах, после чего вычисляют показатель функциональной активности супрессоров (СА) по формуле CA =

=ДАт ДА (1-Tc)100), где ДАт — активность дегидрогеназы лимфоцитов в мазках с розеткообраэующими клетками после 40-42 мин инкубации с теофиллином; ДА — активность дегидрогеназы лимфоцитов в реакции розеткообраэования беэ предварительной инкубации лимфоцитов с теофиллином; Тс— общее количество Т-супрессоров, определенное в реакции розеткообразования. При значениях показателя функциональной активности супрессоров (СА) от 0,1 до 1,1 или от 2,0 до 10,0 диагностируют соответственно снижение или повышение функциональной активности Т-лимфоцитов.

Использование способа возможно в любой иммунологической лаборатории, применяющей метод розеткообразования. Способ наряду с оценкой функциональной активности позволяет количественно определить уровень Т-супрессоров в крови, укорачивает время исследования до 1 — 2 сут (по прототипу 6 — 7 сут).

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Лимфоциты крови выделяют на градиенте плотности фиколл-верографина (р =

=0;077 г/л), дважды отмывают раствором

Хэнкса, концентрацию клеток доводят до

2 10 /мл, 1702316

50

Готовят две пробы, пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде М 199 в течение 40-42 мин при 37 С, затем отмывают забуференным физраствором, В пробирки с 0,1 мл раствора, содержащего лимфоциты, предварительно инкубированные (!) и неинкубированные (нтактные) (II) с теофиллином, приливают

0,1 мл оаствора эритроцитов барана (5х 10 /мл), инкубируют в термостате при

37 С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4 С) на 30 мин, затем осторожно ресуспендируют и делают мазки на тщательно отмытых стеклах, В этот же день мазки после их высушивания окрашивают на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов. Перед г!роцедурой окраски готовят раствор сукцината натрия; к 2,95 r янтарной кислоты приливают 1 мл дистиллированной воды и 2 гидроокиси натрия, после растворения готовят 0,2 М раствор в дистиллированной цоде, Растворяют 0,013 r паранитротетраэоЛия фиолетового в 10,0 мл дистиллированНой воды, фильтруют. добавляют 0,015 г трилона Б, 10,0 мл фосфатного буфера (рН =

=7,4) и 10,0 мл 0,1 М раствора янтарно-кислого натрия. После фиксации мазков в насыщенном растворе трилона Б в ацетоне (20 с)

Дважды промывают в дистиллированной во !е и инкубируют в приготовленной среде в

1ечение 60 мин на водяной бане при 37 С, Затем сушат и красят 1 -ным водным рас1 вором метилового зеленого (2 мин). Подсчет роэеткообраэующих лимфоцитов (окруженных тремя и более эритроцита-. ми барана) и лимфоцитов, розеток на

Образующих производят путем микроскопии не менее 200 клеток в каждом мазке.

Одновременно подсчитывают количество гранул сукцинатдегидрогенаэы лимфоцигоа, После этого определяют процент роэеткообразующих лимфоцитов в пробах I и II, вычисляют количество Т-лимфоцитов-супрессоров по разности между процентом розеткообразующих лимфоцитов во II u пробах, а затем рассчитывают супрессорную активность T-лимфоцитов СА по формуле

CA = ДАт/(ДА (1-Tc/100)), где ДАт — активность дегидрогеназы лимфоцитов в мазках с розеткообразующими клетками после 40 — 42 мин инкубации с теофиллином;

ДА — активность дегидрогеназы лимфоцитов в реакции розеткообраэования без предварительной инкубации лимфоцитов с теофиллином;

Тс — количество Т-лимфоцитов-супрессоров, определенное в реакции розеткообразования, и при значениях показателя.супрессорной активности (СА) от 0,1 до 1,1 или от 2,0 до

10,0 диагностируют соответственно снижение или повышение функциональной активности Т-лимфоцитов-супрессоров.

Пример 1, Исследуемый К., 26 лет, практически здоров. Выделяют лимфоциты крови, взятой из локтевой вены, центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографина (р = 0,077 г/л), дважды отмывают раствором Хэнкса, концентрацию клеток доводят до 2 10 /мл. Одну пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде N 199 в течение

40-42 мин при 37 С, затем отмывают забуференным физраствором. В пробирки с 0,1 мл раствора, содержащего лимфоциты, предваритель .о инкубированные (!) и неинкубированные (интактные) (ll) с теофиллином, приливают 0,1 мл раствора эритроцитов барана (5 10 /мл), инкубируют в термостате при 37 С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4 С) на 30 мин, затем осторожно ресуспендируют и де- лают мазки на тщательно отмытых сте лах.

После высушивания мазки окрашиваюг на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов по описанной методике. Подсчитывают розеткообразующие лимфоциты в I и !! пробах (не менее 200 клеток в каждом мазке), Выявлено роэеткообразующих лимфоцитов в пробе — 58, во II — 104. Подсчет

Т-супрессоров проводят по разности между процентом розеткообразующих лимфоцитов во II и пробах, т.е. (104/200) 100(58/200) 100 = 23 (), Одновременно подсчитывают количество гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах и Il.ïðoá.

Получены данные: в i пробе — 96, во !! пробе—

82. Вычисляют супрессорную активность Тлимфоцитов по формуле

СА = ДАт/(ДА (1 — Тс/100) = 96/82 х х 1 — 23/100) = 1,5.

Делают заключение в нормальной супрессорной активности Т-лимфоцитов. Активность супрессоров параллельно определяют в течение 7 сут, Индекс супрессии составил 36,5 . что также свидетельствует о нормальной функции Тлимфоцитов-супрессоров.

Пример 2, Больная М., 46 лет. Диагноз: рак желудка, 3 стадии. Выделяют лимфоциты крови, взятой из локтевой вены, центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографина (р = 0,777 г/л), 1702316 дважды отмывают раствором Хэнкса, концентрацию клеток доводят до 2 10 /мл.

Одну пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде М 199 в течение 40 — 42 мин при 37 С, затем отмыва- 5 ют забуференным физраствором. В пробир; ки с 0,1 мл раствора, содержащего. лимфоциты, предварительно инкубированные (!) и неинкубированные (интактные) (II) с теофиллином, приливают 0,1 мл раство- 10 ра эритроцитов барана (5 10 /мл), инкуби т руют в термостате при 37 С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4 С) на 30 мин, затем осторожно ресуспендируют и де- 15 лают мазки на тщательно отмытых стеклах.

После высушивания мазки окрашивают на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов по описанной методике, Производят подсчет розеткообразующих лимфоцитов в 20

I и !! пробах (не менее 200 клеток в каждом мазке). Выявлено розеткообразующих лимфоцитов в пробе 78, во II — 110, Подсчет

Т-супрессоров осуществляют по разности между процентом розеткообразующих лим- 25 фоцитов во II u I пробах, т.е. (110/200) 100(78/200) 100 = 16 (). Одновременно подсчитывают количество гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах и II проб.

Получены данные: в I пробе — 105, во II 30 пробе — 34. Вычисляют супрессорную активность Т-лимфоцитов по формуле

СА = ДАт/(ДА (1-Tc/100)) = 105/(34х х(1-16/100)) = 3,7.

Делают заключение о повышенной суп- 35 рессорной активности Т-лимфоцитов, функциональная активность Т-супрессоров параллельно определяла в течение 7 сут.

Индекс супрессии составил 52,6, что также свидетельствует о повышенной функции 40

Т-лимфоцитов-супрессоров.

Пример 3. Больная С., 52 г. Диагноз: ревматизм, активная фаза, 2 степень активности, острая тромбоэмболия сосудов мозга. 45

Выделяют лимфоциты крови, взятой из локтевой вены, центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографина (р =

=0,077 г/л), дважды отмывают раствором

Хэнкса, концентрацию клеток доводят до 50

2 10 /мл. Одну пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде

М 199 в течение 40 — 42 мин при 37 С, затем отмывают забуференным физраствором. В пробирки с 0,1 мл раствора, содержащего 55 лимфоциты, предварительно инкубированные (I) и неинкубированные (интактные) (!!) с теофиллином, приливают 0,1 мл раствора эритроцитов барана (5 10 /мл), инкубируют в термостате при 37 С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4 С) на 30 мин, затем осторожно ресуспендируют и делают мазки на тщательно отмытых стеклах.

После высушивания мазки окрашивают на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов по описанной методике, Подсчитывают розеткообраэующие лимфоциты в и !! пробах (не менее 200 клеток в каждом мазке). Выявлено розеткообраэующих лимфоцитов в пробе 134, во !! — 152. Подсчет

Т-супрессоров осуществляют по разности между процентом розеткообразующих лимфоцитов во !! и пробах, т.е. (152/200) 100(134/200) 100 = 9 (). Одновременно. подсчитывают количество гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах и II проб.

Получены данные: a I пробе — 58, во !! пробе—

79, Вычисляют супрессорную активность Тлимфоцитов по формуле

СА = ДАт/(ДА (1-Тс/100)) = 58/(79х х (1 — 9/100)) = 0,7

Делают заключение о снижении супрессорной активности Т-лимфоцитов, что явилось показанием для назначения иммуномодуляторов. При проведении лечения тималином (иммуномодулятор) отмечено клиническое улучшение, что подтверждает результаты лечения, Функциональная активность Т-супрессоров параллельно определялась в течение 7 сут, Индекс супрессии составил 5,2, что также свидетельствует о снижении функции Т-лимфоцитов-супрессоров.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно сократить время, необходимое для проведения исследования (с 7 до 1 сут), При проведении исследования не требуется соблюдения стерильных условий, что значительно облегчает работу, Предложенный метод более точен и позволяет диагностировать нарушения супрессорной активности лимфоцитов в тех случаях, когда по данным других методов изменения активности Т-супрессоров не выявляются. Применение метода возможно в любой иммунологической лаборатории. При проверке предложенного метода по сравнению со способом-прототипом установлено повышение точности на 18, что позволило повысить клиническую эффективность лечения иммуномодуляторами больных, у которых были обнаружены изменения супрессорной активности Т-лимфоцитов только при исследовании предложенным методом.

1702316

Формула изобретения

Составитель Н.Калинин

Редактор А.Маковская Техред М,Моргентал Корректор О,Кундрик

Заказ 4541 .Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Способ определения функциональной активности Т-лимфоцитов-супрессоров путем постановки реакции розеткообразования с . эритроцитами барана, о т л и ч а ю ц и и с я тем, что, с целью сокращения времени и повышения точности определе ния, реакцию ставят параллельно в 2-х пробах с интактными лимфоцитами и предварительно инкубированными в течение 40-42 мин с теофиллином, проводят подсчет розеткообразующих лимфоцитов в мазках из обеих проб с одновременным определением количества гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах, после чего

5 вычисляют соотношение активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов, инкубированных и неинкубированных с теофиллином, и при значении показателя соотношения 0,11,1 определяют снижение супрессорной ак10 тивности Т-лимфоцитов, а при значении

2,0-10,0 определяют повышение супрессорной активности Т-лимфоцитов.