Способ получения ксантиноксидазы

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способам получения ксантиноксидазы , и может быть использовано в инженерной энзимологии. Цель изобретения - упрощение процесса и удешевление целевого продукта. Способ включает экстракцию зародышей зерна пшеницы буферным раствором, прогревание экстракта при 55-65°С в течение 5 мин, фракционирование сульфатом аммония и очистку методом ИОХ и ИЭФ. Степень очистки 1093. 1 табл. со с

COIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 9/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

i".. "..:": ТЕг(А

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

О (л)

С)

Ф 4 (21) 4704254/13 (22) 14.06.89 (46) 23.11.91. Бюл. N 43 (71) Институт молекулярной биологии и биохимии им. M. А, Айтхожина (72) 3. А. Аликулов. Б. М. Бесбаева и К, T.

Якупбаев (53) 477, 15.07(088.8) (56) 1, Triplett Е. W., Нао А, С. Molecular and

Sегоlogical Comparisons of purified Xanthine

Dehydrogenases from Root Nodules of Three

Ureide. — Producing Legume Species, Physiologfa Plantarum, 1988, v. 74, ¹ 1, р.

164-168.

2.Кильдибеков Н. А. Сравнительное исследование молибдокофактора нитрат-редуктазы бактероидов Ruzophulm luniml и . ксантиноксидазы молока. Дисс, канд. биол. наук. M.. 1983.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения ксантиноксидазы (КО), и может быть использовано в инженерной энзимологии.

Известен способ выделения КО (КДГ) из корневых клубеньков 3 видов бобовых —. сои, вигны и фасоли Лима с использованием моноклональных Антител к КДГ сои (Ц.

Наиболее близким и изобретению по технической сущности является способ получения КО из животного источника — сливок, включающий отделение масла, фракционирование бутанолом, трехкратное высаливание сульфатом аммония, хроматографию на гидроксилапатите и гельфильтрацию (2).

Недостатками известного способа являются необходимость свежевыделенных сливок из парного молока, трудоемкость

„„50„„1693047 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КСАНТИНОКСИДАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения ксантиноксидазы, и может быть использовано в инженерной энзимологии. Цель изобретения — упрощение процесса и удешевление целевого продукта. Способ включает экстракцию зародышей зерна пшеницы буферным раствором, прогревание экстракта при

55-65 С в течение 5 мин, фракционирование сульфатом аммония и очистку методом ИОХ и ИЭФ. Степень очистки 1093, 1 табл. процесса отделения масла, длительное фракционирование (17ч) бутанолом — токсичным органическим растворителем (сыворотка:бутанол 5:1). Дпя выделения КО по данному способу требуется от 4 до 5 дней, Целью изобретения является упрощение процесса и удешевление целевого продукта.

Способ включает обработку исходного сырья и очистку продукта. причем в качестве исходного сырья используют зародыши пшеницы — отходы мукомольно-крупяного производства, которые обрабатывают буферным раствором, полученный экстракт прогревают при 55-65 С, а разделение бес- клеточного экстракта проводят методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭцеллюлозе и изоэлектрофокусированием.

1693047

Общий белок, мг

Этапы очистки

Удельная активность, ммоль/мин мг белка

Степень очистки

Общая активность, мкМ/мин

200

2,4

176

145

30

290

103

26

0,8

25,8

10,5

936

13125

1093

Составитель А.Семенов

Редактор О,Юрковецкэя Техред М.Моргентал Корректор T.Ïàëèé

Заказ 4051 Тираж Подписное

BHVli/lllVl Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-З5, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина. 101

Пример. 10 г зародышей зерна пшеницы растирают в ступке в 50 мл 0,1 M

Na-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 10 мм восстановленного глутатиона, 10 мМ Na2Mo04. Эту смесь центрифугируют при 12000 g в течение 15 мин при 4 С. Бесклеточный экстракт прогревают от 55 до 65 С 5 мин, охлаждают до 15 С, Денатурированные балластные белки осаждают центрифугированием при 12000 g в течение 10 мин при 4 С. Белки надосадочной жидкости после центрифугирования осаждают сульфатом аммония до 35% и центрифугируют. Осадок растворяют в 0,1 M трис-буфере, рН 8,2, и пропускают через сефадекс С-25 для обессоливания, Фракции первого пика пропускают через ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-52-целлюлозе и элюируют 0,2 М NaCI. Фракции, обладающие КО активностью. подвергают препарэтивному изоэлектрофокусированию (ИЭФ).

Экстракт зародышей

Прогревание экстракта

В ысаливание сульфатом аммония и ГПХ на сефадексе 6-25

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозы

ИЭФ

Изоэлектрофокусирование ведут в градиенте концентрации сахарозы 5-50% с

1,5%, амфолинов, рН 3-10. Размеры колонки

1,6х30 см, напряжение 500 В, время 12 ч, 5 температура 10 С. Полученный препарат электрофоретически гомогенен. Результаты очистки приведены в таблице.

Следует особо отметить, что при прогревании активность КО зародышей пшеницы

10 резко увеличивается.

Формула изобретения

Способ получения ксантиноксидазы, включающий экстракцию исходного сырья и очистку экстракта, отличающийся тем, 15 что, с целью упрощения процесса и удешевления целевого продукта, в качестве исходного сырья используют зародыши зерна пшеницы, которые экстрагируют буферным раствором, содержащим соль молибдена, 20 экстракт прогревают при 55-65 С и подвергают очистке методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и иэоэлектрической фокусировки.