Способ определения активности супероксиддисмутазы

 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в биохимических и клинических исследованиях, а также для контроля технологического процесса получения препарата супероксиддисмутазы (СОД) в микробиологической промышленности. Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности определения, удешевление способа. Для определения активности СОД используют вновь установленную реакцию автоокисления флавоноида растительного происхождения-кверцетина в присутствии тетраметилэтилендиамина при оптимальном соотношении концентраций реагентов: 0,8 мм тетраметилэтилендиамин в 0,015 М фосфатном буфере при конечном PH 10 и 0,08 мм этилендиаминтетраацетат. Реакцию характеризуют величиной изменения оптической плотности при 406 нм за 20 мин. 3 табл., 6 ил.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„ I 521773

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГЗЭСУДАРСТВЕНКЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЙМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21 ) 4280355/31-13 (22) 04.07.87 (46) 15.11.89. Бюл. Р 42 (71) Белорусский государственный университет им. В.И.Ленина (72) В.А.Костюк, А.И.Потапович и И.Б.Афанасьев (53) 577,15(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 855502, кл. С 12 N 9/02, 1981.

Beanchamp С., Fridovich 3. Anal.

В1осЬет. 1971, v.44, р.276-287.

{54 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ (57) Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в биохимических и клинических исследованиях, а также для контроля

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в биохимических и клинических исследованиях, а также для контроля технологического процесса получения препарата супероксиддисмутазы (СОД) в микробиологической промышленности.

Цель изобретения — повьппение специфичности и чувствительности определения и удешевление способа.

На фиг. 1 показано изменение спектра кверцетина в процессе его окисления {1- исходный спектр; 2,3,4,5спектр после 5, 10, 15 и 20 мин окисления);.на фиг. 2 — зависимость степени торможения реакции автоокисления кверцетина от концентрации СОД; на

{51) 4 С 12 N 9/02, С 12 g 1/00//С 01 N 33/573

2 технологического процесса получения препарата супероксиддисмутазы (СОД) в микробиологической промышленности.

Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности определения, .удешевление способа.

Для определения активности СОД используют вновь установленную реакцию автоокисления флавоноида растительного происхождения — кверцетина в присутствии тетраметилэтилендиамина при оптимальном соотношении концентраций реагентов. 0,8 мМ тетраметилэтилендиамин в 0,015 М фосфатном буфере при конечномрН 10 и 0,08 мМ этилендиаминтетраацетат. Реакцию характеризуют величиной изменения оптической . плотности при 406 нм за 20 мин.

3 табл., б ил.

1вай

С фиг. 3 — зависимость скорости окисления кверцетина от рН; на фиг. 4 — зависимость скорости окисления кверцетина от концентрации фосфатного буфера; на фиг. 5 — зависимость скорости окисления кверцетина от концентрации тетраметилэтилендиамина (ТИЭДА); на

C .фиг. 6 — зависимость скорости окисления кверцетина от времени инкубации.

Способ заключается в том, что для определения активности СОД используют «Ь» вновь установленную реакцию автоокисления флавоноида растительного происхождения — кверцетина в присутствии тетраметилэтиленциамина, К 2,5 мл

0,02 М фосфатного буфера, рН 7,8, добавляют 0,5 мл 0,005 И раствора ТМЭДА, 1521773

7 торможения

Ю щ опытная проба х 100, Dqpq контрольная проба

Опыт

Опытная проба

Контрольная Холостая проба проба

0,07

0,07

0,07

1 0,05

2 0,05

3 0,05

0,08

0,08

0,08

Ж торможения =

= 25/. приготовленного на 0,5 мМ растворе

ЭДТА, и 0,1 мл 0,5 мМ раствора кверцетина. Установлено, что в этом случае имеет место зависящее от анион5 радикала кислорода окисление молекулы кверцетина, сопровождающееся увеличением максимума поглощения в области 335 нм и исчезновением в области 406 нм (фиг. 1). Ловушка синглетного кислорода — азид натрия (6

Стenema торможения реакции окисле- 15 ния кверцетина,зависит от концентрации добавленной СОД и эта зависимость представляет собой монотонно возрастающую кривую, представленную на фиг. 2. По этой кривой определена ве- 20 личина Х О, соответствующая количеству фермента, ингибирующего реакцию ! автоокнсления кверцетина на 50, и равная 1,4 нг/мл.

На основании сравнения величин -I 25 можно утверждать, что данный способ примерно в 6 раз чувствительнее прототипа и в 35 раз чувствительнее способа, основанного на реакции автоокисления адреналина. ЗО

Активность фермента сохраняется постоянной в интервале рН от 4,8 до I0. Максимальная скорость процесса имеет место при максимальном значении оптимума рН анализируемого фермента, т.е. рН 10 (фиг. 3), концентрации фосфатного буфера 0,015 М (фиг. 4) и концентрации тетраметилэтилендиамина (ТМЭДА), равной 0,8 мМ (фиг, 5), Максимальное время, соответствующее ли- 0 нейному участку зависимости количества окисленного продукта от времени реакции 20 мин (фиг. 5,6) максимальные спектральные изменения, отражающие процесс окисления кверцетина, наблю- 45 дают при длине волны ДВ 406 нм (см. фиг. 1) .

Пример 1. К стандартной инкубационной среде, содержащей 2,5 мл

Q,U2 М фосфатного буфера, рН 7,8, и

0,5 мл 0,005 М ТМЭДА, приготовленного на 0,5 мМ. растворе ЭДНА, добавляют

0,2 мл синовиальной жидкости, разведенной в 10 раэ, и 0,1 мл 0,5 мМ рас- . твора кверцетина в диметилсульфоксиде опытная проба; 0,2 мл синовиальной жидкости, разведенной в 10 раз и выдержанной в кипящей водяной бане

10 мин, и 0,1 мл 0,5 мМ раствора квер60 ьИ), каталаза (0,01-100 мкгlмл) не оказывают влияние на этот процесс.

В то же время очищенный препарат СОД с удельной активностью 3000 U/êã его ингибирует. Степень ингибирования . оценивается по отношению величины изменения оптической плотности при

406 нм (Л 1) 406 ) в присутствии СОД к ll Dpyg в контрольной пробе, не содержащей фермента за 20 мин, цетина — контрольная проба;,Р, 2 мп физиологического раствора и 0,1 мл

0,5 мМ раствора кверцетина — холостая проба.

Оптическую плотность при 406 нм определяют сразу после добавления кверцетина и через 20 мин. Результаты приведены в табл. 1.

Т а б л и ц а,1

Результаты трех параллельных определений активности СОД в синовиальной жидкости больного ревматоидным артритом

Изменение оптической плотности при 406 нм за 20 мии (л0) Процент торможения реакции окисле(ния кверцетина под действием экзогенной супероксиддисмутазы вычисляют по уравнению

ADA контрольная - bD4os опытная х100Ж

40.1,@ холостая

О 07-0 05

Ж торможения = - — — — — х 1001. =

0,08

Из графика, приведенного на фиг.2, определяют количество СОД в пробе:

СОД = 0,5 нг/мл.

Содержание СОД в синовиальной жидкости рассчитывают, учитывая ee pasведение: СОД = 0,5 нг 3,3 ° 50 =

= 82,5 нг/мл синовиальной жидкости.

5 l52

lI р и м е р 2. К стандартной инкубационной среде, содержащей 2,5 мл

0,02 M фосфатног о буфера, рН 7,8, и

0,5 мп О, 005 M ТМЭДА, приготовленного на 0,5 мМ растворе ЭДТА (конечный рН составного буфера 10), добавляли

0,1 мп крови, полученной из пальца пациента и разведенной в 600 раз дистиллированной водой, и 0,1 мп 0,5 мМ раствора кверцетина в диметилформамиде — опытная проба; О, 1 мл крови, разведенной в 600 раз и выдержанной в кипящей водяной бане 10 мин, и

0,1 мл 0,5 мМ раствора кверцетина контрольная проба; 0 1 мл дистиллированной воды и О, 1 мл 0,5 мМ раствора кверцетина — холостая проба. Анализ проводили как и в случае примера 1.

Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Результаты трех параллельных определений активности СОД в крови человека

1 773

6 квер цетина — холостая пр оба . Результаты приведены н табл. 3.

Таблица 3

Результаты трех параллельных опре- делений активности СОД в гомогенате печени крыс

Опыт Изменение ойтической плотности при 406 нм за 20 мин (dD) 1 0,06 0,08 0,08

2 0,06 0,08 0,08

3 0,06 0,08 0,08

Расчеты ниполняют аналогично примеру 2.

0,08-0 06

/ торможения = - х 100%

0,08

25 ..

Опытная проба

Ко нтр ол ьна я проба

Холостая проба

Из графика, приведенного на фиг.2, определяют количество СОД в пробе:

СОД = 0,05 нг/мл.

Содержание на 1 г печени: СОД =

0,5 3,2 " 50000 = 80 мкг /г ткани .

Пример 4. Способ реализуют в наборе реактивов, состоящем из 4 флаконов и рассчитанном на 100 определе35

Флакон А из темного стекла, объем

15 мл содержит 1,5 мг кверцетина.

Флакон Б содержит 10 мл диметилсульфоксида, Флакон В, объем 75 мп, содержит

0,35 ТМЭДА.

Флакон Г содержит 50 мп 0,5 мМ раствора ЭДТА. 0,02 М фосфатный буфер, рН 7,8, приготавливают отдельно.

Для проведения анализа содержимое флаконов Б и Г приливают соответственно во флаконы А и В, растворы перемешивают и выдерживают 2 ч, после чего используют для проведения анали50 .за в соответствии с описанием, приведенным в примере, После смешивания реактивы могут быть использованы в течение 2 сут, 1 0,04

2 0,04

3 0,04

0,08

0,08

0,08

0,08

U,О8

0,08 — 501

Из графитка, приведенного на фиг.2, определяют количество СОД в пробе:

СОД = 1,4 нг/мп.

Содержание СОД в крови рассчитывают, учитывая выполнение разведения:

СОД = 1,4 3,2-6000 = 26,8 мкг/мл .

Опьп Изменение оптической плотности при 406 нм за 20 мин (И)) Опытная Контрольная Холостая проба проба проба .

0 08-0 04 торможения = -ь — — х 100

0,08

Пример 3. К стаццартной инкубационной среде добавляют О, 1 мл раз.веденного в 500 раз 1О/ гомогената печени и 0,1 мп 0,5 мМ раствора кверцетина в диметилформамиде — опытная проба; 0,1 мп разведенного в 500 раз

10 гомогената печени, выдержанного в кипящей водяной бане 10 мин, и

О, 1 мл 0,5 мМ раствора кверцетина контрольная. проба; О, 1 мл дистиллированной воды и 0 1 мп 0,5 мМ раствора

Ф о р м у л а и з о б р е г e H H я

Способ определения активности cy.HepoêñèäöHñìóòàзы, предусматривающий оценку степени торможения реа кции окисления субстрата анион-раггпкалом

1521773

ИМ кислорода в присутствии тетраметилэтилендиамина (ТМЭДЛ) пь иэменению величины оптической плотности в реакционной смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности определения, а также удешевления способа, в качестве субстрата окисления используют кверцетин, реакцию проводят в течение 20 мин при рН 1О в 0,015 И фосфатном буфере в присутствии 0,8 мМ

ТИЭДА, в реакционную смесь дополнительно вносят 0,08 мМ этилендиаминтетраацетат, а величину оптической плотности определяют при длине волны

406 нм.

1521773

1, ) . ф

1

1

PcfP. 3

065 Р./Р Д1Ó

Ф, фкФаю эж

Фиг 4 М Р

0,10 ц zu за 40 УР ии. авиа Р

1Ю мм, ТМЯЯ4

Филя

Составитель E. Воробьева

Техред Л.Олийнык Корректор C. Черни

Редактор Н. Киштулинец

Заказ 6892/24 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101