Способ иммунологического анализа

 

Изобретение относится к иммунологии , в частности к методам определения антигенов с помощью иммунологических тестов. Целью изобретения является повышение реакционной способности в отношении тестирования высокомолекулярных антигенов. Дпя этого дополнительно добавляют в смесь антигена и специфических антител ггоотеин А и антисыворотку к бактериофагу , При этом учет реакции осуществляется по степени нейтрализации биологического действия бактериофага, добавляемого на заключительной стадии постановки реакции. 2 ил. с S

(У1)5 G 01 И 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ы!-" -ьч .. +,ф Яф,,1д Фф coto3 сОВетсних -. . 6; ;: -У у="

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К А ВТОРСНОМ .Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4758543/13 (22) 16.11.89 (46) 30.10.91.Бюл.К - 40 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) В.Д.Ягудин (53) 616.070.73 (088.8) (56) Фримель Х.Иммунологические методы, М., Медицина, 1987.с.152-155.

Скворцов В.Т. Определение микроколичеств антител и антигенов при помощи вироиммунотеста/ Сб.: Иммуносорбенты и их использование в биотехнологии. НИИ им.Н.Ф,Гамалеи АМН СССР, N., 1986. с.49-61.

Изобретение относится к иммунологии, в частности к методам определения антигенов с помощью иммунологических тестов.

Целью изобретения является повьппение реакционной способности в отно- шении тестирования высокомолекулярных антигенов.

На фиг.1 дана схема осуществления предлагаемого способа; на фиг.2— график зависимости инактивации БОЕ от концентрации ВШ.

Пример 1. В качестве антигена используют суспензию очищенного вируса, выделенного из больных пло довых тел шампиньонов (А.bisporus) (BBI), спектрофотометрически определяют его концентрацию — 3 мг/л. Пу-, тем жчмунизации кроликов ВШ получают антисыворотку — АС ш, определя„„SU„„1688164 А 1 (54) СПОСОБ К1МУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА (57) Изобретение относится к mmyuoлогии, в частности к методам определения антигенов с помощью иммунологических тестов. Целью изобретения является повышение реакционной способности в отношении тестирования высокомолекулярных антигенов. Для этого дополнительно добавляют в смесь антигена и специфических антител протеин A H антисыворотку K бактериофагу. При этом учет реакции осуществляется по степени нейтрализации биологического действия бактериофага, добавляемого на заключительной ста- с

Ю дии постановки реакции, 2 ил. ют ее титр в реакции двоинои радиальной иммунодиффузии (1:128) и количество иммуноглобулинов фракции

IgG — 2 мг/л. Параллельно получают антисыворотку к бактериофагу Т4Д (АС ), специфичному в отношении бактерчй Е.coIi и определяют максимальное ее разведение, нейтрализующее 95-100Ж фаговых частиц при их .концентрации 500-1000 в 1 мл, это

-;разведение составило 1:500. Готовят также раствор бычьего сывороточного альбумина — БСА — 0.2Х и протеина

А - 15 мкг/мл в калий-фосфатно-солевом буфере /КФСБ), рН 7,5.

Для проведения реакций антисыворотки протеин А используют в заведомо избыточных концентрациях, т.е. в концентрациях, выше необходимых для протекания реакции: AC „, — 1:100, АС вЂ”

1688164 ф о < > о б

1:100, протеин Л вЂ” 15 мг/мл, непрореагировавшие остатки реагентов отмы— вают трижды по 2 мин 0,05Н КФСБ с до бавлением 0,1% Тнина/20 и один раз дистиллированной водой (используют стерильные растворы и стерильные инструменты и посуду).

Реакцию проводят я лунках поцистироловых планшетов. В лунки вносят

1О по 100 мкл десятикратных разведений суспензии ВШ, в.качестве отрицательного контроля вносят суспензию вируса табачной мозаики (ВТМ) — 3 мг/мл, а также КФСБ. Анализ осуществляют в трех повторностях.

Сорбцию антигенов проводят в течео ние ночи при 4 С. После промывания лунок в них последовательно вносят (с промежуточными промываниями) bCA, АС „ »" 20 протеин А, ЛС,, 100-200 БРЕ бактерио-га т471, Инкубацию всех реагентов, кроме бактериофл.а, осуществляют при 37"С в течение 1 ч., зктериофаа — при 4 С в течение ночи.

После инкубации содержимое лунок с бактериофагом асептически переносят в слой питательнсго агара, напри мер МПА, с культурой Е.ca1i в чашках

Петри (по методу Грациа) и инкубируют при 37 0 оТ 6;qo 18 ч. Подсчитыо

30 вают число негативных колоний (БОЕ), образованных на бактериальном газоне, и по сравнению с результатами отрицательных контропей (КФСБ, RTM) определяют число нейтрал зованных БОЕ (сред-З5 нее из трех повторностей) „По полученным данным в системе координат вычерчивают график зависимости инактивации БОЕ от концентрации ВШ (фиг.2).

Пример 2. В качестве антигена используют раствор полиэдрина белка оболочки вирусов ядерного полиэдроза вирусов непарного шелкопряда (концентрация 3 мг/мл), получают к нему кроличью антисыворотку (титр .1:128), иммунологическую реакцию ставят по вышеприведенной схеме, Как следует из полученных результатов, чувствительность предлагаемо" го иммунологического теста при анализе В01 составила не ниже 3 фг/мл, а полиэдрина — 0,3 фг/мл, что сопостави мо с чувствительностью других методов на основе вироиммуно гестов (ВИТ), применяемых для относительно простых органических веществ.

ФормуJIа изобретения

Способ иммунологического анализа, включающий инкубирование исследуемого антигена со специфическими антителами, антителами к бактериофагу и бактериофагом, дальнейшим высевом реакционной смеси на газон тест-культуры и учетом результата по наличию зон лизиса тест-культуры, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения реакционной способности в отношении тестирования высокомолекулярньrx антигенов, антитела к искомому антигену и антитела к бактериофагу связывают путем добавления протеина А.

1688164

LAcsnw8u175

1/5

ЮО

5П

Хо зп 40 иг )мл мкг)мл аг/м мг1мл фг/й

Конценарацця онл иаеноВ

ЯЫГ

Составитель С.Светлышев

Редактор А.Лежнина Техред М,Дидык

Корректор Н. Ревская

Заказ 3705 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101