Способ определения белка в растворе

 

Изобретение относится к биологии, биотехнологии и медицине, может быть использовано в клиниках и применяться для определения концентрации белка в автоматизированном режиме при биотехнологических процессах, конкретно для солюбилизированных детергентами растворов мембранных белков Цель изобретения - определение белка в присутствии ПАВ при одновременном повышении точности способа Сущность способа заключается в том, что предварительно снимают спектры поглощения растворов белка с поверхностноактивным веществом и самого поверхностно-активного вещества при той же концентрации в УФ-диапазоне длин волн 200-260 нм. определяют две длины волны при которых ошибка определения концентрации белка минимальна, и затем рассчитывают концентрацию исследуемого белка Предлагаемый способ поселяет п. о водить определение бепка в поисутствии ПАВ и повысить точность определения в 6 4 раза. 1 табл

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСтИЧНжих

РЕСПУБЛИН (si)s G 01 N 33/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4466719/14 (22) 25.07.88 (46) 15.06.91, Бюл. ¹ 22 (71) Научно-исследовательский институт физико-химической медицины (72) В.Е.Третьяков, В.В.Шубин и B.Þ.Óâàров (53) 612,015 (088.8) (56) Иммунологические методы исследования. М.: Мир, 1988, с, 125, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА В

РАСТВОРЕ (57) Изобретение относится к биологии, биотехнологии и медицине, может быть использовано в клиниках и применяться для определения концентрации белка в автоматизированном режиме при биотехнологических процессах, конкретно для

Изобретение относится к биологии, биотехнологии и медицине и может быть использовано при количественном определении белка в биологических жидкостях и на этапах технологических процессов, а именно для солюбилизированных детергентами растворов мембранных белков.

Цель изобретения — определение блока в присутствии поверхностно-активных веществ при одновременном повышении точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Снимают спектр раствора поверхностно-активного вещества (ПАВ) и исследуемого раствора белка в ПАВ в ультрафиолетовом диапазоне длин волн

200 — 260 нм, находят две длины волны, при котором поглощение растворов одинаково и

) . Ы 1656458 А1 сол юбилизированн ых детергентами растворов мембранных белков. Цель изобретения— определение белка в присутствии ПАВ при одновременном повышении точности способа. Сущность способа заключается в том, что предварительно снимают спектры поглощения растворов белка с поверхностноактивным веществом и самого поверхностно-активного вещества при той же концентрации в УФ-диапазоне длин волн 200 — 260 нм, определяют две длины волны, при которых ошибка определения концентрации белка минимальна, и затем рассчитывают концентрацию исследуемого белка. Предлагаемый способ позьоляет проводить определение белка в присутствии

ПАВ и повысить точность определения в 6,4 раза. 1 табл. рассчитывают концентрацию белка С по формуле

С =(1/! х Е) 2 х А1, )> где — длина оптического пути;

E>,г — разность коэффициентов молярной экстинкции при двух найденных длинах

Волн (А1 и i4);

А1,г — разность величин поглощения раствора исследуемого белка при длинах волн А1 иА2.

Пример. Определялись концентрации четырех белков; бычьего сывороточного альбумина (БСА). человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), цитохрома С лошади и миоглобина кашалота в растворах, содержащих разное количество Эмульгена 913 (до

0,01 7 j, неионного детергента, широко используемого для выделения мембранных белков.

1656458

Эмульген (белок)*

Белок

Ошибки п и on еделении кон ент а ии,,**

10 +.4

1 3

9 -1-1

23 1

0,04-0,08

0,4-0,8

0,04-0,15

0,32 — 0,9

БСА

12+ 5

17+ 6

10+ 5

9 +2

12+ 5

11 4

10 + 5

3+6

3 5

7+5

6:"5

7+5

3 +.3

1 «-5

7+3

5 2

ЧСА

Среднее по, БСА и ЧСА

Цитрохром

4 ="2

1 1

3 + 1

-0,5+ 1

1 w2 — 12 й5

6 + 2 — 3 +.2

159 +5

154 +. 5

94 +.5

97 +5

-4 +. 1 — 19 :"7

6 3 — 10 3

29 8

27+ 5

18+ 5

15+4

0,04 — 0,09

0,4-0,9

0,02 — 0,16

0,31-0,9

Миоглобин

Среднее по гемопротеинам

125

Спектры поглощения растворов укаэанных белков, белков с Эмульгенам 913 в различных концентрациях и Эмульгена 913 при тех же концентрациях регистрировались с помощью спектрофотометра "Gewlett 5

Packard HP-85" (США) в кювете с длиной оптического пути 1 мм в области длин волн от 200 до 260 нм.

Поиск длин волн проводился посредством минимизации относительной случай- 10 ной ошибки определения концентрации белка по всем парам длин волн в интервале, от 205 до 225 нм и с использованием ЭВМ.

Одновременно рассчитывалась концентрация белка по формуле 15

С = К1л ЛА a где K1,2 = 1/! х Е1,2, в которой величина К1,z была усреднена по 11 белкам, фосфоглюкозоизомеразе, глицерофосфатдегидрогеназе, альдолаэе, триозо- 20 фосфатизомераэе, фосфоглицераткиназе, л а ктатдегидрогеназе, алко гол ьдегидроген азе, миоглобину, цитохрому С, БСА(все белки фирмы "Serva", США), ЧСА (Fiuca, ФРГ).

Рассчитанные концентрации белков 25 сравнивали с контрольными концентрациями, определенными гравиметрически. Полученные экспериментальные ошибки в определении концентрации белков для оптимально подобранных длин волн приведе- 30 ны в таблице, Данные таблицы формулы расчета концентрации белка можно испольэовать с учетом погрешности для любого исследуемого белка в растворах, содержащих до 0,01% Эмульгена 913. 35

Использование предлагаемого способа определения концентрации белка в растворах, содержащих неизвестное количество поверхностно-активного вещества, обеспечивает по сравнению с существующими 40 способами следующие преимущества: возможность определять белок в растворах, содержащих ПАВ: возможность более точной количественной оценки концентрации белка (как видно иэ таблицы, при усреднении расчетом концентрации по трем укаэанным формулам, предложенный способ позволяет уменьшить погрешность оценки до 7%, по прототипу — 32%).

В таблице приведены данные, характеризующие определение концентрации белка в присутствии Эмульгена 913.

Кроме того, предлагаемый способ сохраняет активные свойства исследуемого белка и не требует использования дорогостоящих реактивов, что уменьшает материальные затраты и увеличивает эффективность использования метода, Формула изобретения

Способ определения белка в растворе, включающий измерение поглощения раствора белка в ультрафиолетовой области и расчет концентрации белка с учетом значения коэффициента малярной экстинкции, отличающийся тем, что, с целью определения белка в присутствии поверхностно-активных веществ при одновременном повышении точности способа, снимают спектр раствора поверхностно-активного вещества в ультрафиолетовой области, находят два значения и4 длины волны, при которых поглощение одинаково, и рассчитывают концентрацию белка по формуле

С = (1/! х E ),2) х A1 z, где — длина оптического пути;

Е1,2 — разность коэффициентов малярной экстинкции при двух найденных длинах волн l1 и )2, А1д — разность величин поглощения раствора исследуемого белка при длинах волн А1 и k2 .

1656458

Продолжение таблицы

* — отношение содержания Эмульгена 913 к содержанию белка:

** — . 1 — расчет предложенным сйособом по формуле С - 0,639 (А2ов — А224)

2 — расчет по формуле С - 0,846 (A210 — A224)

3 — расчет по формуле С = 1,113х(А212 — А224)

4 — биуретовым методом (2); 5 — методом Моури (3).

Составитель Н.Гуляева

Техред М.Моргентал Корре ор М,Пожо

Редактор А.Ревин

Заказ 2050 Тираж 417 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101