Способ получения иммобилизованного фермента

 

Изобретение относится к медицине , в частности к способу получения иммобилизованного фермента. Цель изобретения - повышение удельной активности фермента. Для этого фермент, Iсодержащий нуклеофильные группы, под (вергают взаимодействию с латексом сополимера на основе мономеров, выбранных из группы, содержащей метилметакрилат, бутилакрилат, метакриламид, изобутилметакрилат, этилметакрилат, оксиэтилметилакрилат, этилакрилат, и мономеров, выбранных из группы, содержащей этиленгликольдиметакрилат, глицидилметакрилат, метакролеин, метакрилат N-оксисукцинимида, сложный N-оксисукцинимидный эфир 6-метакрилоиламиногексановой кислоты , продукт присоединения сложного 2-оксиэтилового эфира акриловой кислоты к 1,6-гексадиизотиоцианату, при массовом соотношении фермента и сополимера , равном (1:1)-(1:330). 6 табл. W

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)5 С О8 F 2 .")/18 8/3 ) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3470942/О5 (22) )4. ()8.82 (31) Р 313l)92>4. ) (32) 05. )8 . 81 (33) ПЕ (46) О7.()6.91 . Бюл. У> 1 (71) Рем П1Г>Х Хемише фабрик (BE) (12) Вернер Зиоль, Дитер Кремер, 1орберт Зюттерлин, Корнелия Феиль, ! ерхард Иаркерт и Зрвин Ыустер ())Е) (53) 618. 164,3)(О88.8),54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИ)1ОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРИЕНТА (5 1) Изобретение относится к медици— не, в частности к способу получения иммобилизованного фермента. Цель изобретения — повышение удельной активности фермента. Для этого фермент, Изобретение относится к области создания иммобилизованных ферментов.

Цель изобретения — повышение удельной активности ил(л(обилизованного фермента.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение, при этом примеры 1-11 иллюстрируют получение полимера, используемого в предлагаемом способе, а примеры 12-29 — осуществление предлагаемого способа.

Пример 1. В полимеризаторе, снабженном обратным холодильником, мешалкой и тормостатом, нагревают до

8ОоС раствор следу(>щего состава, г: раствор фосЛатного буфера (рН 7,О) (1 ); натриевая < оль 4,4 -азобис-(4содержащий нуклео(>ильные группы, под-! вергают взаимодействию с латексом сополимера на основе мономеров, выбранных из группы, содержащей метилметакрилат, бутилакрилат, метакриламид, изобутилметакрилат, этилметакрилат, оксиэтилметилакрилат, этилакрилат, и мономеров, выбранных из группы, содержащей этиленгликольдиметакрилат, глицидилметакрилат, метакролеин, метакрилат N-оксисукцинимида, сложный N-оксисукцинимидный эфир 6-метакрилоиламиногексановой кислоты, продукт присоединения сложного

2-оксиэтилового эфира акриловой кислоты к 1,6-гексадиизотиоцианату, при массовом соотношении фермента и сополимера, равном (1:1) †(1:33 )).

6 табл . цпановалериановой кислоты) 0,4; лаурилсульфат натрия О,З; дистиллированная вода 555.

К этому раствору добавляют капля(и также при 8 ) С в течение 4 ч, о эмул ь сию, содержащую, r: ме тилме такрилат 36 ); бутилакрилат 21О; глицидилметакрилат 3 ); натриевая соль 4,4 азобис- (4-циановалериановой кислоты) 2; лаурилсульфат натрия 3; дистиллиро ванная вода 84О.

Затем перемешивают еще в течение

2 ч при Sl)0С, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют . Получают не содержащую коагулят дисперсию. Содержание твердого вещества составляет

16553 )1 около 3i)7,, значение рН 7,3, вязкость

2 мПа с.

Пример 2, В полимериэатор, снабженный обратным холодильником и термостатом, подают раствор следующего состава, г: раствор ЬосАатного буАера (рН 7,()) 50; лаурилсульфат натрия

° 0,3; натриевая соль 4,4 -азобис-(4циановалериановой кислоты) <),3; дистиллированная вода 515, и нагревают до 8l) С.

К этому раствору добавляют при

80 С в течение 4 ч эмульсию, содержащую, г: метилметакрилат 300; бутил- 15 акрилат 210; глицидилметакрилат 90; натриевая соль 4,4 -азобис-(4-циано-! валериановой кислоты) 2; лаурилсульАат натрия 3; дистиллированная вода 840.

Затем перемешивают в течение 90мин о при 81) С, охлаждают до комнатной температуры и Аильтруют. Получают хорошо

Аильтруемую, не содержащую коагулят дисперсию. Содержание твердого вещества составляет около 307, значение рН 7,1, вязкость 1 мПа с.

Дисперсия содержит полимер указанного в примере 1 состава.

Пример 3. В полимеризатор, снабженный обратным холодильником, мешалкой и термостатом, подают раст- вор следующего состава, r: лаурилсульфат натрия 6,5; натриевая соль

4 4 -азобис-(4-циановалериановой кисЭ 35 лоты) 0,6; раствор фосфатного буфера, (рН 7,0) 10,0; дистиллированная вода 600,0, и нагревают до 80 С.

К этому раствору добавляют каплями 40 при 8 ) С в течение 3 ч эмульсию, со, о держаг ую, r: метакриламид 18; этиленгликольдиметакрилат 11; метилметакрилат 150; глицидилметакрилат 18(); лаурилсульАат натрия 1,5; натриеная 45 соль иэ 4,4 — азобис-(4-циановалериаI новой кислоты) 2,0; дистиллированная вода 9()О.

Затем перемешивают еще в течение ,о, 30 мин при 8() С, охлаждают до комнатной температури и Аильтруют. Получают хорошо Аильтрусмую, не содержащую коагулят дисперсию. Содержание твердого вещества 19,4Õ, значение рН 7, 7, вязкость 2 мПа с.

Пример 4. Повторяют пример 3 с той разницей, что добавляют эмуль— сию следующего состава, г; метакриламид 18> этиленгликольдиметлкрнлат 36; метилметакрилат 125; глицидилметакрилат 18().

Вспомогательные вещества, продолжительность полимеризации и температура полимериэации те же самые, что и в примере 3. Получают хорошо Аильтруемую, не содержащую коагулят дисперсию.

Содержание твердого вещества 19,7, значение рН 7,6, вязкость 1 мПа с.

Дисперсия содержит полимер приведенного в примере 3 состава.

Пример 5. а. В реактор, снабженный обратным холодильником, мешалкой и термометром, подают 1600 r воды и нагревают о до 8 ) С, После добавления 3 г изобутилметакрилата, 3 г метилметакрилата, 0,3 r этиленгликольдиметакрипата и

0,8 г лаурилсульАата натрия добавляют

4 r персульАата аммония,. растворенного в 36 r воды. Затем добавляют каплями в течение 2 ч при 80 С смесь 200 r иэобутилметакрилата, 21И г метилметакрилата и 20 r этиленгликольдиметакрилата.

После добавления мономера смесь о перемешивают в течение 1 ч при 80 С.

Получают свободную от коагулята, хорошо Аильтруемую, ниэковяэкую 203-ную дисперсию, б. В реактор, снабженный обратным холодильником, мешалкой и термометром, подают 330 г воды. Затем добавляют

10 мл фосфатного буАерного раствора со значением рН 7 (Титризоль Аирмы

Мерк) и 16 ) г йсходной дисперсии а.

>1осле нагревания до 8 ) С добавляют 3,4 r натриевой соли 4,4 -азобис-(4циановалериановой кислоты) в 4 мл воды. Затем добавляют в течение 3 ч о при 8() С эмульсию, состоящую из

10() ) r воды, 1 г лаурилсульфата

I натрия, 2 г натриевой соли 4,4 -аэобис-(4-циановалериановой кислоты), 16() r этилацетата и 145 г иэобутилметакрилата.

Затем в течение 6() мин добавляют раствор 11) r амида метакриловой кислоты и ),6 r натриевой соли 4,4 -аэобис-(4-циановалериановой кислоты) в

300 г води, а также мономерную смесь, состоящую иэ 50 r этилакрилата, 45 r глицидилметакрилата. Затем перемешивают еще в течение 6 ) мин при 8 ) С.

Получают свободную от коагулята низковяэкую дисперсию с содержанием твердог о вещества,".)7..

5 165530

Il p и м е р 6. Повторяют пример 5 с той разницей, что подают н течение

3 ч при 8 ) С эмульсию, состоящую из о

1<)<И) г воды, 1 г лаурилсуль<%ата натрия, 2 r натриевой соли 4,4 -азобис(4-циановалериановой кислоты), 160 г этилакрилата, 145 г изобутилметакрилата и 1,5 г этиленгликольдиметакрилата. 10

Затем н течение 61) мин добавляют раствор 11) г амида метакриловой кисf лоты и 0,6 r натриеной соли 4,4 -азобис-(4-цианоналерианоной кислоты) н

300 г воды, а также мономерную смесь, 15

cocToH)< из 5 ) г этилакрилата, 45 г глицидилметакрилата и 0,5 г этиленгликольдиметакрилата. Затем перемеши,о вают еще н течение 60 мин при 8" C.

Получают свободную от коагулята низковязкуи дисперсию с содержанием твердого вещества 207,.

Дисперсия содержит полимер приведенного в примере 5 состава.

Пример 7. Повторяют пример 5 с той разницей, что используемый на последней стадии полимеризации раствор содержит 25 r оксиэтилметакрилата (вместо 10 г метакриламида), 7 ) г этилакрилата (вместо 50 r) и 5 г мет- 30 акролеина (в опыте А) или 5 r метакрилата N-оксисукцинимида (н опыте Б) вместо 45 r глицидилметакрилата.

В обоих случаях получают свободную от коагулята низковязкую дисперсии. 35

Пример 8. В полимеризаторе растворяют при 8 ) С в 53 ) r воды

0,5 г натриеной соли 4,4 -азобис-(4циан«валериановой кислоты) и 0,15 г лаурилсульфата натрия. К этому раствору 40 добавляют в течение 3 ч при 81) С эмульсию, состоящуи из 156 г этилакрилата, 142,5 г изобутилметакри Ip та, 1,5 r этиленгликольдиметакрилата, 0,9 r лаурилсупьфата натрия, 1,8 r 45 натриевой соли 4,4 -азобис-(4-циано1 валериановой кислоты) и 901) r воды.

Затем добавляют в течение 1 ч при

80 С эмульсии, состоящую из 70 r этил- 50 акрилата, 25 г метилметакрилата, 5 г глицидилметакрилата, ),6 г натриевой соли 4,4 -азобис-(4-циановалериановой кислоты) и 3 И) г воды.

По истечении 15 мин после подачи дисперсию охлаждают до комнатной температуры.

Содержание сухого нещества 20K, значение рН 7,1.

6

II р и и е р ). )3 дисперси««-

Пример 10. Повторяют пример.1 с. той разницей, что используют моно мер состава, r: метилметакрилат 360;

<бутилакрилат 2l) ); сложный N îêñèñóê цинимидный эфир 6-метакрилоиламино-! гексаноной кислоты 40.

Получают дисперсию с содержанием твердого вещества около 3 ) вес .l.

Пример 11.

Повторяют пример 1 с той разницей, что используют мономер состава, г: метилметакрилат 380; бутилакрилат 200; продукт присоединения сложного 2-оксиэтилового эфира акриловой кислоты к 1,6-гексадиизотиацианату 20.

Получают дисперсию с содержанием твердого вещества около 31)7.

Пример 12. Иммобилизация энзима рибонуклеаза.

11)1) мг рибонуклеазы (E.С.2. 7, 7, 16) из панкреазы (удельная активность

14,6 U!ter) с рибонуклеиновой кислотой в качестве субстрата, растворяют в 1 мл Э,Э5 М фосфатного буфера с рН 7,5. I<. этому раствору добав-; ляют при перемешивании 5 мл дисперсии согласно примеру 2. Затем отстаивают н течение 3 дней при 23 С.

Переработку ос .щестнляит путем трехкратного суспендирования в 50 мл раствора 1М хлористого натрия и последующего центрифугирования. Затем еще 2 раза промывают 50 мл 0,1)5 И фосфатного буфера.

Выход 1, 1 r влажного продукта.

Согласно анализу надосадочной жидкости и промывной воды выход иммобилизонанного продукта составляет 507.

Активность энзима определяют путем алкалиметрическогo титрования при

37 С и рН 7,5 с рибонуклеиновой кислотой в качестве субстрата.

Результаты сведены в табл .1.

Пример 13. Иммобилизация энзима трипсина.

Повторяют пример 12 с той разницей, что в качестве энзима используют

1655301

100 мг трипсина (F.,0.3.4.4,4) от теленка (удельная активность 14U /мг с использованием казеина в качестве субстрата и 51,4 U/Mr с использованием БАЭЭ вЂ” гидрохлорид сложного этилового эйира — N -бензонл-аргинина

0С в качестве субстрата).

Согласно анализу надосадочной жидкости и промывной воды выход иммо- 10 билизованиого продукта составляет

52%.

Определение активности энзима осуществляют алкалиметрическим титровакием при 37 С и рН 7,5 (БАЭЭ) или рН

8,0 (казеин).

Результаты сведены в табл . 2.

Пример ы 14-19. Иммобилиза-, ция энзима трипсина.

Повторяют пример 13 с той разни- 20 цей, что энзим и латекс берут в соотношении, указанном в табл, 3.

Согласно анализу надосадочной жидкости и промывной воды выход иммобилизованного продукта в примерах 14-19 25 составляет 80, 74, 88, 62, 50 и 58Х соответственно.

Л р и м е р 20. Иммобилизация энзима пенициллиновой амидазы.

Повторяют пример 12 с той разницей,30 что в качестве энзима используют

100 мг пенициллиновой амидазы (Е.С.

3.5.1.11) Еscherichia coli (удельная активность 10 U!Mr).

Согласно анализу налосадочной жид 35 кости и промывной воды выход иммобилизованного : продукта составляет 55 .

Активность энзима определяют путем измерения при 37 С и рН 7,8 (субстрат: калиевая соль пенициллина).

Результаты сведены в табл.4.

Пример 21. Иммобилизация энзима рибонуклеаза.

Повторяют пример 12 с той разницей, что используют латекс согласно 45 примеру 3.

Согласно анализу надосадочной жидкости и промивной воды выход иммобилизованного продукта; составля- ет 56 .

Результаты сведены в табл. 5.

Пример 22. Фиксация энзима рибонуклеаза на бумаге, активированной путем пропитки дисперсии примера 1.

55 а. 100 мп дисперсии согласно примеру 1 разбавляют 500 мп дистиллированной води. Этой " 5 .-ной дисперсией пропитывают бумагу размером 100 см .

Затем отжимают, оставляют в течение

1 ч при комнатной температуре и заD тем сушат при 80 С в течение 30 мин.

Обработанная таким образом бумага содержит 20 г полимера на 1 м . Эту реактивную бумагу можно хранить при температуре ниже -15 С по меньшей мере в течение 12 мес. б. 100 мг рибонуклеазы (из пакреазы) растворяют в 2 мл ), 05 М фосфатного бункера (рН 7, 5) . Этим раствором пропитывают обработанную на стадии а бумагу и затем оставляют стоять в течение 72 ч при 23 С. Затем отжимают и 3 раза промывают 1 н. раствором хлористого натрия и 2 раза 0,05 M раствором Аос<Ьатного бункера (рИ 7,5).

При этом активность (третье применение) составляет 2 U!r влажной бумаги.

Условия определения активности: температура 37 С, рН 7,5 ° Выход ак-. тивности иммобилизованного продукта 0,4 .

Пример 23. Повторяют при-, мер 12 с той разницей, что используют энзим трипсин. При этом активность (третье применение, субстрат БАЭЭ, рН 7,5, температура 37 С) составляет

2,5.U/ã влажной бумаги.

При этом выход иммобилизованного продукта составляет 58, а выход его активности О, 1 .

Пример 24. Повторяют пример 22 с той разницей, что для пропитки бумаги используют дисперсию с меньшей концентрацией (100 мп дисперсии согласно примеру 1, разбавленной 200 мл дистиллированной воды).

Условия сушки: 12 ч при 25ОС в камерной сушилке с циркуляцией воздуха, Твердое вещество полимера/м бумаги 33 г, Затем осуществляют фиксацию энзима трипсин аналогично примеру 22.

При этом активность (третье применение) составляет 4, 1 U!r влажной бумаги с применением субстрата БАЭЭ со значением рН 7,5 при 37 С, а выход активности иммобнлизованного продукта 0,15 .

Пример 25. Повторяют пример 24 с той разницей, что для пропитки используют латекс согласно примеру 2 (разбавление аналогично примеру,24:

200 мл дисперсии в 200 мл дистиллированной воды).

1655301

Твердое вещество полимера/м бумаги=27 г. При этом активность ! (третье применение) составляет 7 U/г влажной бумаги (субстрат БАЭЭ, рН

7,5, температура 37 С), а выход активности иммобилизованного продукта 0;25Х.

Пример 26. Повторяют при мер 22 с той разницей, что пропптку ,бумаги осуществляют дисперсией при мера 1О, доведенной до содержания твердого вещества 10 путем добавле, ния дистиллированной воды, и в качестве энзима используют трипсин. l5

При этом активность (третье применение) составляет 5,2 и 2,5 U/ã влажной бумаги соответственно.

Пример 27. Иммобилизация

Escherichia co1i.

К 10 мл 20 -ной суспензии Escherichia co1i в Аизиологическом растворе поваренной соли добавляют 1О мл дисперсии согласно примеру 4. Затем оставляют стоять в течение 24 ч при 25 комнатной температуре. Получают сетчатый материал, который очищают путем центриАугирования, Выход влажного продукта 4,5 г, а выход иммобилизованного продукта .. 30

100 . (в надосадочной жидкости и в промывной воде больше не обнаруживается).

Данные по активности влажного продукта и выхода активности иммобилизованного продукта сведены в табл . табл. 6.

Пример 28. Повторяют пример 13 с той разницей, что используют дисперсию примеров 5-7. При этом ак- 40 тивность (третье применение, казеин в качестве субстрата) составляет 30,5;

29,8 и 31,2 U/г соответственно, Пример 29. На 100 шариков согласно примеру 9 наливают 2 ) мл ан- 45 тител, получаемых из антисыворотки (иэ коз) против человеческого глобулина путем сродственной хроматограАии и последующего разбавления 0,5 М АосАатного буАера (рН 7,5) до концентрации 30 мкг/мл .

Смесь оставляют стоять в течение ночи при 23 С без встряхивания и беэ перемешивания. Затем декантируют и

3 раза промывают 0,5И АосАатного буАера. Затем лльбумином сыворотки крови крупного рогатого скота (1 в 0,1И фосАатного буАера, рН 7,5) инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре и затем еще рлз промывлнт > рлв ),1M АосАатного буАера (рН 7, 5, содержащего 0,1 вес . азидл нлтрпя).

Один из обработанных таким обрлзом шариков подают в пробирку, дилметр которой На 1 мм больше, чем диаметр шарика. В нее подают О,? мл разбавленной 0,02 M АосАатного буфера рН 7,5, О, 15 M NaC1, до 1: 10 ) )О человеческой сыворотки и инкубируют в течение

30 мин при комнатной температуре, Затем шарик промывают 0,02 M содержащего NaC1 Аосфатного буАера и к нему добавляют (), 2 мп продукта из пероксидазы и античеловеческого глобулина (из коз), который предварительно разбавляют содержащим ИаС1 АосАатным буАером и инкубируют в течение ч при комнатной температуре. Затем хорошо промывают содержащим NaC1 АосАатным буфером, после чего к шарику добавляют 0,2 мл раствора субстрата, состоящего из смеси 5%-ного раствора пирогаллола в воде и раствора перекиси водорода (5 в О, 1 М АосАатного буфера, рН 6,()). )атарик инкубируют в субстрате при комнатной температуре. Уже по истечении 15 мин наблюдается четкая желтая окраска шарика, которая в течение дальнейших 45 мин переходит в оранжевую. Желтая и оранжевая окраски вызываются образующимся на пирогаллоле вследствие энэиматической реакции пурпуроглллином, который в месте его образования (т.е. на поверхности шарика) выделяется в нерастворенном виде.

Сравнительные опыты. Трипсин, рибонуклеаза и пенициллиновая амидаза

Аиксировались на следующих носителях:

Š— продукте Г-Гель- 10 (сополимере на основе глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата), полученном от группы чехословацких исследователей под руководством проАессора Швеча;

II — бисерном полимере на основе NIN метилен-бис †(метакриламида), метакриламида, метакриловой кислоты, глицидилметакрилата и простого аллилглицидилового эфира в весовом соотношении

39,1:18,6:3,3:19,5:19,5 (полученном согласно примеру 2 выпоженной заявки

ФРГ )"- 2722751); III — полимерном латексе примера 4.

Опыты проводят следующим образом.

Опыт А. фиксация трипсина.

240 мг трипсинл (от крупного рогатого скота, активность 3,5 Б/мг) 1655301 растворяют в 4 мл ), 1М натриево-Aoc{) v фатного буАера с температурой 8 С и рН 8,6 и добавляют к 1000 мг указанных полимеров I, II u III (полимер III применялся в виде латекса).

Смесь размешивают, отстаивают при

23 С в течение 72 ч, последовательно промывают 2 раза 1М хлористого натрия и 2 раза 0,05 М АосАатного буфера с рН 7,5 и затем определяют энзиматическую активность U/г влажного продукта (в мкмоль гидролизованного убстрата/мин) путем щелочнометрическоо

ro титронания при 37 С и рН 7,5

15 (БАЭЗ в качестве субстрата) или р Н

8,0 (казеин в качестве субстрата) .

При этом получены следующие результаты: 22 !) и 2>4 при использовании полимера I, 194 и 11 при использовании полимера II и 276 и 28,5 при использонании полимера III (в виде латекса).

Опыт b. Фиксация рибонуклеазы.

50 мг рибонуклеазы (5 раз крист., 25 высокочистая, из сыворотки) растворяют в !,{) мл ),? II гидрогенАосАата натрия при комнатной температуре и добавляют к 25{) мг указанных полимеров 1, II u III (полимер III применя- 3р ют в ниде латекса). Затем смесь размешивают и отстаивают при 23 С в течение 72 ч. Далее смесь последовательно промывают 5 раз 1М хлористого натрия и 2 раза 0,05 М АосАятного ! буфера с рН 7,5, после чего определяют энзиматическую активность U/г влажного продукта (в мкмоль гидролпзованного субстрата/мин) путем щелочнометрического титрирования при 4р

37 C и рН 7,5 (рибонуклеиновая кислота н качестве субстрата).

При этом получены следующие результаты: 9,4 при использовании полимера Х, 94 при использовании полимера II и 1{)5 при использовании полимера III (н виде латекса).

Опыт В. Фиксация пенициллиновой амидазы.

60 г энзима (F,.col i, активность

23,6 U/ìã) растворяют н 2,0 мл О, 1М натриено-АосАатного буАера с рН S,О и добавляют к 500 мг указанных полимеров I II u III (полимер III применяют в виде латекса). Смесь размеб 55

{иинают, отстаивают при 23 С в течение 72 ч и 2 раза промывают ),05 М натриево-АосАатного буАера с рН 7,5.

Затем определяют энзиматическую активиост U/ã влажного продукта (н мкмоль гидролизованного субстрата/мин) с применением калиевой соли пени{в{ллина С в качестве субстрата.

При этом получены следующие результаты: 3, 1 при использовании полимера I, 21 7 при использовании полимера II и 234 при использовании полимера III (в виде латекса) .

Опыт Г. Повторяют опыт А с той разницей, что трипсин подвергают ацилированию хлорангидридом акрилоной кислОть{ и последующей сополимеризации с акриламидом н условиях примера 1 авт. св. !{ - 545648 . Активность получаемого при этом сополимера ацилнрованного трипсина с акриламидом составляет !12 и 15,8 U/г соответственно.

Опыт Д. Повторяют пример 29 с той разницей, что используют шарик, покрытый продуктом Г-Гель-70 и бисерным полимером

При этом в обоих случаях наблюдается только слабо — желтоватое окрашинание шарика .

Результаты сравнительных опытов свидетельствуют о том, что предлагаемый способ позволяет повысить качество Аиксации, благодаря чему содержащее нуклеоАильные группы вещество проявляет повышенную активность, Формула изобретения

Способ получения иммобилизованного фермента путем контактирования фермента, содержащего нуклеофильные группы, с сополимером акрилоных эАирон и глицидилметакрилата, о т л ич а ю {q и и с я тем, что, с целью повышения удельной активности иммобилизонанного фермента, в качестве акрилового сополимера используют латекс сополимера на основе мономеров, выбранных из группы, состоящей из метилметакрилата, бутилакрилата, метакриламида, изобутилметакрилата, этилметакрилата, оксиэтилметакрилата, этилакрилата, и мономерон, выбранных из группы, состоящей и 3 этиленгликольдиметакрилата, глицицилыетакрилата,метакролеина, метакрилата

N-оксисукцинимида, сложного М-оксисукцинимидного эАира 6-метакрилоил— аминогексановой кислоть{, продукта присоединения сложного 2-окснэтилового эАира акриловой кислоты к 1,6-гек1 садиизотиоцианату при массоном соотношении Аермента и сополимера 1:1—

1:330.

16553 )!

Таблица!

Актив нос т ь* навески влажно го

Выход активносПрименение

Навеска влахного npoти иммобнлнзованнопродукта, V!r дукта, r го продукта, 7.

7,6

4,12

3,83

101

54,8

51, () 1,!«

1,75

1, 74

4,13

3,9

55,0

51,9

1,68

1,71

1И соответствует 1 мкмоль/мин (по начальной скорости).

Та блица 2 ктив иост ь*, /г (субстат:казеин

Применение

Активность Выход ак

V/г (субст- тивности рат:БАЭЭ) иммобили

Выход активности иммобизованлизованно1о ного про дукта, .7. продукта, Первое

Второе

Третье

Четвертое

*Активность в пересчете на навеску влажного продукта.

Таблица3

При- Навеска мер трипсина, V/ìã

Навес ка

Соотнове

Выход активАктивность*, /r (субстат:каэеин) ности иммобилизо ванного текса продукта, X

*Активность определена каждый раэ при третьем применении.

14

16

17

18

2 ) 0

Первое

Второе

Третье

Четвертое

Пятое

174

163

161

161 твердого вещества латекса, мг

20 )

2, )0

)00

200

3,55

3,53

3,48

3,48 ние трип син:твер дое веще ство ла1: 1 )

1:5

1:-,5

1:)

1:1,25

1:1

42,5

26,7

23,3

23,3

3,7

13,8

22,2

23,2

26,4

22,3

3,31

2,08

1,81

1,81

0,3

0,5

0,4

0,33

0,23

О, 16

1655301

Та блица 4

BbKOJT, ак I HH

Активность, U! r навески

Применение влажного продукта

Т а блица 5

Активность, U!r навески

Выход активПрименение ности иммобилизованлажного про ухта ного продукта, %

4,56

61,0

Та блица 6

ыход ак—

Активность*, U!ã влажного

Применение тивности иммобилипродукта зованного продукта, %

*При 37©С с использованием калиевой соли 3%-ного пенициллина.

Составитель В.Полякова

Редактор С.Пекарь Техред А.Кравчук Корректор Л.Патай

Заказ 1960 Тираж 320 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина, 101

Первое

Второе

Третье

Первое

Второе

Третье

Четвертое

Первое

Второе

Третье

Четвертое

42,7

47. 0

41,6

68,5

61,8

61,8

118

66

53 ности иммобилизованного продукта, %

4,06

4,0

3,96

5,12

4,62

4,62

91

8S