Штамм культивируемых клеток животных mus мusсulus l., используемый для получения гибридомы

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении гибридом. Цель изобретения - получение штамма опухолевых клеток-партнеров со сниженной зависимостью от макрофагального фидера, повышенной скоростью пролиферации и выходом гибридом. Штамм получают из клеток Sp 2/0 путем селекции на резистентность к бромистому этицию (ЕВ) в концентрации 5 мкг/мл. Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки эмбриона коровы, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютамина, меркаптоэтанола и 40 ед/мл гентамицина. Птамм отличается от исходного появлением по крайней мере двух хромосомных маркеров, устойчивостью к ЕВ, а также к 0,5 мкг/мл колхицина, и 0,074 мкг/мл актиномицина Д. Гибридомы, полученные при гибридизации лимфоцитов мышей с клетками заявляемого штамма, растут без добавления макрофагов и выход продуцентов антител вдвое выше, чем при использовании линии-прототипа Sp 2/0 Ag 14, Штамм депонирован под № ВСКК(П)309Д. О $

A@03 СОВЕТСНИХ

РЕСГ1У БЛИК

А1

ÄÄSUÄÄ 1641 4 (д) 5 С 1 2 N 5 /00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHOA

ПРИ ГКНТ СССР

: (21) 4618802/13

1 (22) 12.12.88 (46) 15.04.91. Бюл. Р 14 (71) Институт цитологии АН СССР (72) Е.В.Березкина, Т.Н.Игнатова и З.В.Ковалева (53) 578.085.23 (088.8) (56) Nature (London), 1978, v. 276, р.р. 269-270.

I (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕГБХ КЛЕТОК

ЖИВОТНЫХ NUS NUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕ, МЫИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДОИЫ (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении гибридом.

Цель изобретения — получение штамма опухолевых клеток-партнеров со сниженнойй за висимос тью от макр офаг ал ьного фидера, повьппенной скоростью пролиферации и выходом гибридом. Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении гибридом.

Цель изобретения — получение штамма опухолевых клеток-партнеров со сниженной зависимостью от макрофагального фидера, повьппенной скоростью пролиферации и выходом гибридом.

Штамм Sp EBR-5 получают следующим образом.

Клетки исходной линии Sp 2/О Ая 14 обрабатывают бромистым этидием (ЕВ) в конечной концентрации 50 мкг/мл в течение 24 N. EB добавляют в среду культивирования следующего состава

Штамм получают из клеток Sp 2/О путем селекции на резистентность к бромистому этицию (ЕВ) в концентрации 5 мкг/MI. Штамм культивируют в среде ДИЕМ с 1 07 сыворотки эмбриона коровы, 1 мИ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютамина, 5 10 М меркаптоэтанола и

40 ед/мп гентамицина. Птамм отличается от исходного появлением по крайней мере двух хромосомних маркеров, устойчивостью к ЕВ, а также к

О, 5 мкг/мл колхицина, и 0,074 мкг/мп актиномицина Д. Гибридомы, полученные при гибридизации лимфоцитов мышей с клетками заявляемого штамма, растут без добавления макрофагов и выход продуцентов антител вдвое выше, чем при использовании линии-прототипа Sp 2/О Ад 14. Штамм депонирован под Р ВСКК(П)309Д.

ДМЕГ1 с добавлением 107 эмбриональной сыворотки, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мИ глютамина, 5 10 М меркаптоэтанола и

40 ед/мл гентамицнна при 37 С. Затем клетки отмывают от ЕВ и культивируют в течение 48 ч. После этого клетки высевают на 24-луночные платы в концентрации 100 тыс. клеток на лунку и культивируют в стандартных условиях с разными дозами ЕВ. B лунках с ЕВ в концентрации 1 мкг/мл .появляются единичные клоны. Один из них выделен и подвергся многошаговой селекции в течение 60 дней с повыше1641884 нием дозы ЕВ до 5 мкг/мп..В результате получен штамм клеток EBR-5, обладающий снижением зависимости полученных на основе этой линии гиб5 ридом,от присутствия макрофагов., повьппенной скоростью пролиферации полученныХ гибридом, а также повышенным выходом гибридом-продуцентов моНАТ.

Штамм депонирован под номером ВСКК(П) Р 309 Д и характеризуется следующими признаками.

Морфология. Культура состоит из клеток одного типа округлой формы.

Культура имеет суспензионный тип

15 роста.

В клетках линии Sp ER R-5 по сравнению с клетками линии Sp 2/О Ag 14 появляется 5 новых хромосомных маркеров (М -М ). Два из них (М -М ) встречаются в подавляющем числе клеток (92 и 88% клеток соответственно) и представляют собой субметацентри:ческие хромосомы, возникшие в результате робертсоновских транслокаций:

tr N (?:2), tr М4, 13:3) . Три других метацентрика (М«-M P встречаются редко - в 8, 12, 16% клеток. И в дицентрическая хромосома, возникшая в результате транслокации хромосомы 4 на хромосому 9 — tr (4:9) (4 А1

Е 9 А - F4) М4 - телоцентрик

tr {14: 7), происхождение телоцентрической хромосомы М неясно. Полученные данные позволяют считать, что клетки $р EBR-5 характеризуются нали- 35 чием специфических маркеров, позволяющих отличать эту линию от исходной клеточной линии Sp 2/О Ag 14.

Штамм клеток Sp KBR-5 при введе40 нии внутрибрюшинно мьнпам линии

Ва1Ь/с по 10 клеток на мышь в

0,5 мп Хэнкса через 10 дней развивается в виде опухоли асцитного типа, 45

Жизнеспособность клеток поддерживается путем пересевов иа свежую питательную среду ДМЕИ с добавлением

10% эмбриональной сыворотки, 1 мМ . заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мИ глютамина, 5,10 пмИ

50 меркаптоэтанола, 40 ед/мл гентамицина с добавлением ЕВ в концентрации

50 мкг/мп. Метод снятия клетокпипетирование кратность рассева

У

1:4, посевная доза 5 10 кл/мп, насыщающая плотность 5 ° 10 кл/мп. 55

Время удвоения популяции 24 ч.

Условия культивирования — на флаконах Карреля при 37 С или в пласти ковых флаконах в С02-термостате при

37 С и 5-7Х CU

Клетки штамма Sp EBR-5 способны расти при 1Х сыворотки со временем удвоения популяции 32 ч, насьппающей плотностью 1-2 ° 10 кл/мл.

Криоконсервирование. Клетки замораживают в эмбриональной сыворотке с добавлением 10% ДМ$0 в концентрации 10 кл/мп, режим замораживания:

1 С/мин до -196 С. Клетки хранят в жидком азоте. Режим оттаивания: водяная баня +40 С в течение 1 мин. Жизнеспособность клеток после криоконсервирования 70% при окраске трипановым синим. Клетки после отогрева переносят из 1 ампулы в свежую среду на 1 флакон Карреля.

Штамм Sp EBR-5 сохраняет неизменными свои биологические характеристики на протяжении 60-кратного,пассирования в присутствии ЕВ в концентрации 5 мкг/мп, а также рекультивирования после размораживания за период времени более 1 года.

Клетки штамма Sp EBR-5 устойчивы кроме ЕВ еще и к колхицину (0,5 мкг/мл) и к актиномицину D (0,074 мкг/мп) в отличие от клеток исходного штамма Sp 2/О Ag 14.

Использование клеток штамма

Sp EBR-5 в качестве клеток-партнеров при гибридизации с лимфоцитамн мышей, иммунизированных эритроцитами коровы, иллюстрируется следующим примером.

Пример. Клетки штамма

Sp EBR-5 культивируют на флаконах

Карреля в течение 48 ч. Посевная доза на флакон 10 клеток/мл. Состав

4 культуральной среды: среды ДИЕИ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мИ глютамина, 5 10 мМ меркаптоэтанола, 40 ед/мл гентамицнна, 5 мкг/мл ЕВ.

Для контроля клетки линии миеломы

Sp 2/О Ag 14 культивируют на флаконах Карреля в течение 48 ч. Посевная доза на флакон была 10 клеток/мп.

Состав культуральной среды: среда

ДМЕМ с добавлением 10Х эмбриональной сыворотки, 1 мИ неосновных аминокислот, 1 мИ пирувата натрия, 2 мИ глю-, тамина, 5 ° 10 мМ меркаптоэтанола, 40 ед/мл гентамицина. Клетки обеих исследуемых миелом гибридиэовапи со спленоцитами, выцеленными из селе1884

Составитель Г.Игнатьева .

Техр ед М, Дидык. Корр ект ор М. Д емчи к

Редактор Т.Лазоренко

Z5t!

Заказ 1126 Тираж 3 76 Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 164 зенки иммунизированных мышей (антигеном для иммунизации являются эритроциты крови крупного рогатого скота) . Гибридизацию проводят посредст-, ВоМ обработки клеток PEG. Далее клетки высевали на 96-луночные план1-. шеты. Через 24 ч после обработки ,РЕС добавляли селективную среду. В случае использования клеток линии Sp 2/О Ag 14 применяют стандартную среду ГАТ, а в случае использования клеток Sp EBR-5 — среду ГАТ с добавлением 1 мкг/мл ЕВ. Когда гибридные .клоны достигают плотности 10

1,5g10 клеток на лунку (плотность определяют визуально), проводят тестирование на наличие AT постановкой реакции гемолиза ° 3a эффективность образования гибридом — продуцентов . моноклонапьных антител (монАТ) принимают долю (7) гибридом; продуци-рующих монАТ от общего числа образо1 вавшихся гибридных клонов.

Выход гибридом-продуцентов монАТ, полученных на основе линии Sp 2/О

Ag 14, составляет 4,837. от общего количества образовавшихся гибридом, а выход гибридом-продуцентов, полученных на клетках штамма Sp EBR-5, составляет в случае культивирования гибридом на макрофагах — 11, 767, без макрофагов — 10, 147..

Таким образом, эффективность образования гибридом-продуцентов монАТ на основе клеток штамма Sp EBR-5 в

2 раза выше, чем на основе клеток линии Sp 2/О Ag 14. Кроме того, гибридомы, полученные на основе клеток штамма Sp EER-5, пролиферируют на ранних этапах развития с более высокой скоростью и растут в отсутствии

20 макрофагов с момента образования. ор мула и з обр е т е ни М

Итамм культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) У 309 D, используемый для Получения гибридомы.