Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l-продуцент моноклональных антител против общего антигена клеток острого лимфобластного лейкоза

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в диагностике острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ). Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к общему антигену клеток ОЛЛ (ОАГ-ОЛЛ), не реагирующие с гранулоцитами крови. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы РЗ X63.Ag8.653 со спленоцитами мышей BAIB/C, иммунизированных клетками периферической крови больного с лимфоидным бластным кризом хронического миелолейкоза. МонАТ отбирают по взаимодействию в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции с лейкозными клетками того же больного. Штамм культивируют на среде ДМЕМ с 15% сыворотки эмбриона коровы. 2 мМ глютамина и 0,1 мг/мл гентамицина. Клетки пересевают через 2-3 дня. Штамм прививается сингенным мышам в виде асцитных опухолей. Штамм продуцирует монAT класса lgC3. Титр монАТ в супернатантах 50, в асцитных жидкостях 10-10 . Штамм депонирован под номером ВСКК(И) № 69 Д. (Л С

СОК33 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (slIs С 12 N 5/00, С 12 Р 21/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4615730/13 (22) 05.12.88 (46) 30.03.91. Бюл. ¹ 12 (71) Всесоюзный онкологический научный центр (72) А.Ю.Барышников, И.В.Дубинкин, Н.Н.Тупицын, О.В,Короткова и З.Г.Кадагидзе (53) 578.085.23 (088.8) (56) Nature, 1980, ч. 284, р, 583-585. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ОБЩЕГО

АНТИГЕНА КЛЕТОК ОСТРОГО ЛИМФОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в диагностике острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ). Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток, Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в диагностике острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ).

Цель изобретения — получение штамма .гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к общему антигену клеток ОЛЛ (ОАГ-ОЛЛ), не реагирующие с гранулоцитами,крови.

Штамм получают следующим способом.

Проводят гибридизацию клеток мышиной миеломы Р3Х63 Ag8,653 и клеток селезенки мыши линии BAIB/3, 3-кратно иммунизированной с 2-недельными интерЮ

„„5U„„1638160 А1 продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к общему антигену клеток ОЛЛ (ОАГ-ОЛЛ), не реагирующие с гранулоцитами крови. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы Р3 Х63.Ag8.653 со спленоцитами мышей BAIB/С, иммунизированных клетками периферической крови больного с лимфоидным бластным кризом хронического миелолейкоэа. MQHAT отбирают по взаимодействию в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции с лейкоэными клетками того же больного.

Штамм культивируют на среде ДМЕМ с

15% сыворотки эмбриона коровы, 2 мМ глютамина и 0,1 мгlмл гентамицина, Клетки пересевают через 2 — 3 дня. Штамм прививается сингенным мышам в виде асцитных опухолей. Штамм продуцирует монАТ класса IgC3. Титр монАТ в супеонатантах 50, в асцитных жидкостях 10 — 10 . Штамм депонирован под номером BCKK(II) ¹ 69 Д. валами клетками периферической крови больного с лимфоидным вариантом бластного криза хронического миелолейкоза.

Лейкозные клетки вводят в количестве

2 10 в хвостовую вену мыши. На 3-й день после последней иммунизации проводят слияние клеток селезенки мыши и мышиной миеломы Р3Х63 Ag8.652. В стерильных условиях извлекают селезенку иммунизированной мыши и клетки выдавливают в стеклянном гомогенизаторе Поттера.

Взвесь клеток фильтруют через 2 слоя марли. Лимфоциты трижды отмывают средой

199 и сливают с клетками миеломы в соотношении 80 х 10 лимфоцитов к 5 х 10

1638160 миеломных клеток, Смесь клеток помещают во флакон объемом 100 мл в объеме 20 мл среды 199, В этом флаконе клетки центрифугируют при 800 об/мин в течение 3 мин и инкубируют 20 мин при 37 С. Среду насухо отсасывают и к клеткам добавляют 3 мл

50%-ного полиэтиленгликоля с мол.мас.

1500, Через 75 с во флакон вносят 20 мл среды 199. Клетки 3 раза отмывают, не встряхивая, и инкубируют при 37 С в течение 5 ч в 20 мл селективной среды

ГАТ/ДМЕМ, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 MM глютамина, 0,1 мг/мл гентамицина 0,0136 мг/мл гипоксантина, 0,000151 мг/мл аминоптерина и

0,00385 мг/мл тимидина. Затем клетки разливают по 0,2 мл в лунки 96-луночного плоскодо IHofo плато. Среду меняют через 2 — 3 дня. Колонии возникают через 25 дней в 96 из 96 лунок. Отбор продуцирующих гибридом проводят в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции (РИФ) на клетках больного, использованных для иммунизации. Положительная реакция в 1 из

96 лунок. Затем супернатант этой гибридомы исследуют на клетках крови здоровых доноров. Клетки из лунки Г 4 дважды клонируют методом предельных разведений на фидере из тимоцитов и спленоцитов. При первом клонировании колонии вырастают в

8 из 12 лунок. Супернатанты во всех из них реагируют в РИФ с клетками, использованными для иммунизации. При втором клонировании колонии вырастают в 5 из 12 лунок, также все положительные в РИФ с клетками больного, использованными для иммунизации.

Полученный штамм обозначен ИКО-35, Штамм гибридных клеток депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных

Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером BCKK(ll) 69 Д.

Культуральные свойства.

Для выращивания штамма используют пластиковую или стеклянную посуду. Во флакон объемом 45 см в 5 мл среды заливают по 5 . 10 клеток штамма. Пассаж 1 раз в 2-3 дня той же дозой. Штамм выращивают при 37 С на среде МЕМ в модификации

Дульбекко, содержащей 15% телячьей эмбриональной или оленьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 0,1 мг/мл гентамицина.

Титр антител определяют в непрямой реакции поверхностной иммунофл юоресценции на живых лимфоцитах крови. В качестве источника антител используют культуральную жидкость, Титр антител в культуральной жидкости 1:50, Для выращивания штамма в виде асцитной опухоли пригодны самки мыши линии

BAlB/С. Интактным мышам за 7-14 дней до прививки опухоли вводят внутрибрюшинно

5 раздражитель (вазелин), клетки штамма иньецируют внутрибрюшинно по 10 клеток

7 на мышь в 4,0 мл среды. Через 7-14 дней у мышей возникают асцитн ые опухоли, Объем асцита от одной мыши составляет 2-3 мл.

10 Титр антител в асцитической жидкости—

104-105

Кариологическая характеристика, Модальное число хромосом — 85. Маркерных хромосом не выявлено.

15 Продуктивность, Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 25 пассажей ин витро и 15 пассажей ин виво. Титр антител в культуральной жидкости 1:50, в асцитической жидкости — 10 .

20 Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и при посевах на питательные среды.

Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тими25 диновой метке культуральной среды.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в среде ДМЕМ, содержащей 15% телячьей эмбриональной или оленьей сыворотки. К суспензии клеток до30 бавляют 10% ДМСО. Концентрация клеток (1 — 2) х 10 мл . Ампулы с клетками помеща7 -1 ют в жидкий азот. Размораживают при 40 С в течение 70 с, Жизнеспособность клеток после размораживания 80 — 90%.

35 Характеристика целевого продукта.

Штаммы гибридных культивируемых клеток ИКО-35 продуцирует монАТ класса

Ag63. Специфичность монАТ ИКО-35 определяют в непрямой реакции поверхностной

40 иммунофлюоресценции по стандартной методике, Моноклональные антитела ИКО-35 не реагируют с мононуклеарами крови здоровых доноров, гранулоцитами, Т- и В-лимфо45 цитами, эритроцитами и тромбоцитами, В костном мозге здоровых людей монАТ ИКО35 определяют от 0 до 9% антигенположительных клеток. В тимусе детей монАТ

ИКО-35 определяют от 0 до 5% антигенпо50 ложительных клеток. В то же время монАТ

ИКО-35 реагируют со всеми ОАГ-ОЛЛ-положительными бластными клетками больных

ОЛЛ и хроническим миелоидным лейкозом в стадии бластного криза. МонАТ ИКО-35

55 реагируют с ОАГ-ОЛЛ-положительной преВ-клеточной линией Reh-6 и не связываются с клетками линий К-562, Jurkat; Prise, HL-1, Molt-4, М -1. Сравнение реактивности монАТ ИКО-35 и монАТ I 5 доказывает их идентичную реакцию с клетками больных, но они

1638160

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1. ВСКК (II)

N 69 Д-продуцент моноклональных антител против общего антигена клеток острого лимфобластного лейкоза.

Составитель Г.Игнатьева

Редактор Л,Веселовская Техред М.Моргентал Корректор И.Эрдейи

Заказ 901 Тираж 375 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 различаются по реакции с гранулоцитами крови, Пример 1. Ребенок, больной острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), подвариант по ФАБ-классификации L 1. 5

Иммунологический фенотип областных клеток костного мозга:

ИКО-1 (1а-антиген 83 );

ИКО-01 (антиген недифференцированных бластов) 17; 10

ИКО-10 (антиген ранних тимоцитов) 0 ;

ИКО-11 (LFA-1 антиген) Оо ;

ИКО-ГМ1 (миеломоноцитарный антиген) 7 ;

И КО-Г2 (х-гаптен) 3 ; 15

НАЕЗ вЂ” (гликофорин А) 0 ;

НАЕ9 — (антиген эритробластов) 0 ;

ИКО-20 (СД38 антиген) 8 ;

ИК0-15.(антиген Е-рецептора) 68 ;

СД5 (антиген Т-клеток) 1 ; 20

СД7 (антиген Т-клеток) 47ь;

СД10 (ОАГ-ОЛЛ вЂ” антиген) 97 ;

ИКО-35 (ОАГ-ОЛЛ вЂ” антиген) 95 ;

Sig (поверхностные иммуноглобулины)

2%; 25

Cylg (цитоплазматические иммуноглобулины) 7,5 .

Иммунологический диагноз — общий

ОЛЛ.

Пример 2. Ребенок, больной ОЛЛ, 30 подвариант по ФАБ-классификации L1.

Иммунологический фенотип бластных клеток.

ИКО-1 (1а-антиген) 76%;

И КО-10 (антиген ранних тимоцитов) 0 ; 35

ИКО-11 ((ГА-1 антиген) 50о ;

ИКО-Г2 (миеломоноцитарный антиген)

0%.

НАЕ3 (гликофорин А) 0 ;

НАЕ9 (антиген эритробластов) 0 ;

И КО-15 (лиган Е-рецептор) 72 ;

И КО-20 (СД 38-антиген) 0,5 ;

СД5 (Т-клеточный антиген) 35ф,;

СД 7 (Т-клеточный антиген) 25,5О ;

СД10 (ОАГ-ОЛЛ-антиген) 76 ;

ИКО-35 (ОАГ-ОЛЛ-антиген) 17 ;

Slg (поверхностные иммуноглобулины)

4 .

Иммунологический диагноз — Т-1-ОЛЛ.

Положительный эффект состоит в том, что монАТ ИКО-35, полученные с помощью предлагаемого штамма, определяют антиген ОАГ-ОЛЛ на бластных клетках, по процентному соотношению которых можно судить о иммунологическом варианте лейкоза.

Преимущество использования монАТ

ИКО-35 по сравнению с прототипом (монАТ

l5) состоит в том, что монАТ ИКО-35 не реагирует с гранулоцитами, что позволяет более точно идентифицировать экспрессию

ОАГ-ОЛЛ на бластных клетках.