Способ определения количества жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в биопрепаратах

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в культурах или биопрепаратах. С целью упрощения способа определения жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в биопрепаратах, в качестве органического фактора роста в питательной среде для выращивания молочнокислых микробов используют неохмеленное пивное сусло, забуференное ацетатом, или сукцинатом, или цитратом натрия, или калия или аммония до рН 6,0-7,0. На этой питательной основе готовят жидкие среды для выращивания накопительных культур а агаризованные для подсчета числа жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в биопрепаратах, при этом высоту слоя как агаризованной, так и жидкой среды устанавливают 4-5 мм. Использование простой в изготовлении и дешевой питательной среды на основе неохмеленного пивного сусла приводит к улучшению условий выращивания бактерий и повышению достоверности в определении числа жизнеспособных клеток. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (111 щ)5 С 12 И 1/20, !./00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4413802/30-13 (22) 20,04.88 (46) 23,10,90. Бюл. Р 39 (71) Свердловский сельскохозяйственный институт (72) А.Я,.Ребров и С.В.Нестерова (53) 577.15 (088,8) (56) Теппер Е.З. и др. Практикум по микробиологии — M.: Агропромиздат, 1987.

"Биоконсервант комплексного действия для силосования растительного сырья (Биосил), Технические условия

ТУ-ОП 64-13-101-86, 1986. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА

ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК МОЛОЧНОКИСЛЫХ

БАКТЕРИЙ В БИОПРЕПАРАТАХ (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в культурах илн биопрепаратах. С целью упрощения способа определения жизнеспоИзобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения жизнеспособности клеток молочнокислых бактерий в культурах или биопрепаратах, Целью изобретения является упрощение способа определения количества жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в биопрепаратах.

Изобретение заключается в том, что в качестве основы для питательной среды, на которой выращивают молочнокислые бактерии, используют неохмеленное пивное сусло, забуференное до рН 6,6-7,0.

2 собных клеток молочнокислых бактерий в биопрепаратах, в качестве органического фактора роста в питательной среде для выращивания молочнокислых микробов используют неохмеленное пивное сусло, забуференное ацетатом или сукцинатом, или цитратом натрия, или калия или аммония до рН 6,0-7,0.

На этой питательной основе готовят жидкие среды для выращивания накопительных культур и агаризованные для подсчета числа жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в биопрепаратах, при этом высоту слоя как агаризованной, так и жидкой среды устанавливают 4 — 5 мм, Использование простой в изготовлении и дешевой питательной среды на основе неохмеленного пивного сусла приводит- к улучшению условий выращивания бактерий и повышению достоверности в определении числа жизнеспособных. клеток. 1 з,п. ф-лы, 2 табл.

Пример 1. Неохмеленное пивное сусло получают с пивзавода в стерильной стеклянной посуде (емкостью 0,5 или 1 л), доставляют в лабораторию, где в нем определяют содержание сахаров (всех — по плотности ареометром Баллинга, глюкозы — ортотолуидиновым методом) и рН. В доброкачественном пивном сусле содержание сахаров должно соответствовать всех 17-19 Б, глюкозы 2-ЗЖ и рН 5,4.

Прозрачную надосадочную жидкость сусла декантируют, осадок отбрасыва-. ют, Прозрачное сусло стерилизуют при

1601116,| 0,5 атм 30 мин, охлаждают и сохраняют при 4-6 С.

Перед применениам стерильное сус†:o разводят стерильной водопроводной о ,гадай точно да 9 E. Отбирают пробу разведенного сусла объемом 25 мл в стаканчик вместимостью.50 мл, снимают кривую титрования в диапазоне рН 7 04,5, используя стеклянный электрод, 0 1 к, pGcTBopbl cBpHoH кислоты и гидраакиси натрия. Рассчитывают буферность этой основы питательной среды.

Она должна бытв в диапазоне 11

13 мэкВ/л.

В основу среды вносят забуферивающую соль — ацетат (или сукцикат или пит ат) натрия (или аммония или калия) до массовой доли безводного вещества 0,5%, соль растворяют. Добав- 20 лением 1 н, раствора гидроокиси натрия устанавливают рН 6,8, снова определяют и расчитывают буферность питательной среды, которая должна соответствовать 38 мэкВ/л, 25

При более низкой буферности (13 мэкВ/л) среда сильно закисляется, угнетается рост колоний: колонии по лучаются очень мелкис . 0,5 мм„а их количество в 1 5 раза уменьшается

Э эО по сравнению со средой с оптимальной буферностью. Забуферивание среды ацетатом до 38 мэкВ/л приводит к уве( личению размера колоний в 1,5-2 раза, При более сильном забуферивании среды (7 мэкВ/л) размер колоний и каг

35 личество клеток не увеличиваются, однако селективный фактор — падкисление — иеключается, тогда при определении молочнокислых микробов в таких

4О субстратах как корма, фекалии и другие вырастают не только молочнокислые, но и другие микробы„ чувствительные к подкислению. Вследствие этого признано целесообразным умеренно забуфе45 ривать среду до 38 мэкВ/л, сохраняя ее селективнасть, Приготовленную питательную среду разливают в требуемые для работы ем(IIpo6HpKH KoJI6bI H т.д. ) ° Высота столба жидкости в них должна быть

4 см и более, Для создания анаэробных условий на питательную среду наливают стерильное вазелиновое масла, высота столба которого должна быть 1„5 см, Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин, 55

0 охлаждают до комнатной (18-20 С) температуры, инокулируют и инкубируют.

Жидкая питательная среда предназначена для глубинного, выращивания малачнокислых микробов.

Для приготовления твердой пита-. тельной среды в подго..овленную основу питательной среды вносят агар до массовой доли 1,57.. См сь нагревают на водяной бане до 90 С и полного расплавления агара, Горячую расплавленную среду фильтруют через марлю, осадок отбрасывают, в Фильтрате индикаторной бумажкой контролируют рН, если необходимо, корректируют.до рН 6,8. Среду стерилизуют автаклавированием при 0 5 атм 30 мин.

Для выращивания и хранения микробов стерильную среду разливают в стео рильные пробирки. При 40 С их инокулируют молочнокислыми микробами, компоненты тщательно перемешивают и ин- . кубируют при требуемой температуре.

Для определения количества жизнеспособкых клеток молочнокислых микробов в препаратах и культурах их асептически разводят на физрастворе в ряду пробирок с шагом десять. Взвесь клеток с концентрацией 100 кл./мл асептически вносят в объеме 1 мл в стерильную чашку Петри; находящуюся на строго горизонтальной поверхности.

В нее я<е асептически:наливают стерильную расплавленную среду с температурой 40 С в таком количестве, чтобы высота слоя ее в чашке равнялась

4 — 5 мм, Компоненты тщательно перемешивают круговыми движениями, llocJIe чего смесь охлаждают до застывания агара, а затем инкубируют при требуемой температуре в течение 1-3 сут ° (в зависимости от вида микроба), Интенсивность раста (размер и ко- . личества колоний) молочнакислых микробов существенна зависит от степени ,анаэробных условий,, определяемой толщиной слоя питательной среды. В тонком слое (1-2 мм) колонии очень мелкие, их количества в 2-4 раза меньше, чем в оптимальном слое (4 5 мм); в более толстом слое (6-8 мм) .размер и количество колоний ке увеличивается, на подсчет их затрудняется вследствие снижения прозрачности среды и увеличения помех за счет наложения колоний друг на друга па толщине, Результаты сравнительного определения числа жизнеспособных клеток малочнокислых бактерий в разных биопрепаратах представлены в табл,1.

Та блица

Среда

52110

201-10

51 10

200 10

Т а б л и ц а 2

Среда

Количество колоний

Размер колонии, мм на чашке кокков палочек

Известная (гидролизат муки и

БВК)

Предлагаемая (забуференное сусло) 12,8

1,03

0,91

11,9

1,37 1,34

Представленные результаты свидетельствуют о том, что более доступная, простая в изготовлении и дешевая среда на основе готового неохмеленного сусла пригодна для определения количества живых клеток в биопрепаратах, а в случае с ацидофилином число определяемых жизнеспособных клеток повышается по сравнению с известной средой.

В табл.2 представлены сравнительные данные по определению молочнокислых микроорганизмов в биопрепарате Галлиферы при его разведении в 10" раз.

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что в твердой прозрачной питательной среде на основе забуференного сусла вырастают колонии, размер которых в 1,5-2 раза больше колоний на известной питательной среде, содержащей гидролизат кукурузной муки и БВК в качестве органических факторов роста. Увеличение размера колоний приводит к повышению

Известная (гидролизат кукурузной муки и БВК)

Предлагаемая (забуференное неохмеленное сусло) 01116 6 достоверности результатов подсчета клеток жизнеспособных молочнокислых микробов в биопрепаратах.

Формула изобретения

1. Способ определения количества жизнеспособных клеток молочнокислых. бактерий в биопрепаратах, предусмат10 ривающий их выращивание на агаризованной питательной среде, содержащей .органический фактор роста, в олти мальных для размножения микроорганизмов условиях с последующим учетом результатов, о т л и ч а ю щ и Й с я тем,что, с целью упрощения способа, в качестве фактора роста используют неохмеленное пивное сусло, забуференное до значения рН 6,6-7,0 а вы-

20 соту слоя питательной среды устанавливают 4 — 5 мм.

2, Способ по п;1, о т л н ч а юшийся тем, что забуферивание неохмеленного пивного сусла производят

25 ацетатом или сукцинатом, или цитратом натрия, или аммония или калия., Число клеток в 1 r биопрепаратов

Еиосил Ацидофилин