Способ получения эндонуклеазы рестрикции @

 

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, касается способа получения эндонуклеазы рестрикции ХЬа I из биомассы клеток Xanthomonas badrii штамм ВКПМ В-2754 (АТСС 11672) и может быть использовано в генной инженерии и молекулярной биологии. Целью изобретения является упрощение процесса с одновременным повышением выхода и качества целевого продукта. Для этого биомассу Xanthomonas badrii разрушают ультразвуком, полученный клеточный гомогенат фракционируют в двухфазной системе, содержащей 7%-ный полиэтиленгликоль и 2%-ный декстран в присутствии 0,35-0,42 М NaCI, хроматографическую очистку препарата осуществляют на гепаринсефарозе путем нанесения фермента на аффинный сорбент, уравновешенный ЮмМ трис-HCI буфером с рН 7,2 с последующим концентрированием целевого продукта диализом против 50%-ного раствора глицерина. Выход эндонуклеазы рестрикции ХВа 1 составляет 12-15 тыс.ед./г биомассы. Препарат свободен от примесей неспецифических эндо-и энзонуклеаз (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

tsi)s С 12 N 9/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4498140/13 (22) 26.10.88 (46) 15.03.91. Бюл, N. 10 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) В.К.Михайлова (53) 577.15.08.155,2(088.8) (56) Майстренко В.Ф. и др. Метод выделения высокоочищенной рестриктазы Xbat.—

Биотехнология, 1986, (Ф 1, 26-30. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ХВА I (57) Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, касается способа получения эндонуклеазы рестрикции ХЬа из биомассы клеток Xanthomonas badrii штамм ВКПМ

В-2754 (АТСС 11672) и может быть использовано в генной инженерии и молекулярной

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, касается способа получения эндонуклеазы рестрикции ХЬа I из биомассы Xanthomonas badrII и может быть использовано в генной инженерии и молекулярной биологии.

Цель изобретения — упрощение процесса с одновременным повышением выхода и качества целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом.

Биомассу клеток X,badrii штамм ВКПМ

В-2754 (АТСС 11672) разрушают с помощью ультразвука, затем к клеточному гомогенату добавляют концентрированную смесь полиэтиленгликоля и декстрана в калий-фосфатном буфере, рН 7,4 до конечной концентрации в смеси полиэтиленгликоля

7%, декстрана 2% и NaCI до концентрации

„„. Ы„„1634713 А1 биологии. Целью изобретения является упрощение процесса с одновременным повышением выхода и качества целевого продукта. Для этого биомассу Xanthomonas

ЬабгН разрушают ультразвуком, полученный клеточный гомогенат фракционируют в двухфазной системе, содержащей 7%-ный полиэтиленгликоль и 2%-ный декстран в присутствии 0,35-0,42 М NaCI, хроматографическую очистку препарата осуществляют на гепаринсефарозе путем нанесения фермента на аффинный сорбент, уравновешанный 10 мМ трис-HCI буфером с рН 7,2 с последующим концентрированием целевого продукта диализом против 50%-ного раствора глицерина.

Выход эндонуклеазы рестрикции ХВа 1 составляет 12-15 тыс.ед,/г биомассы, Препарат свободен от и римесей неспецифических эндо- и энзонуклеаз.

0,35 — 0,42 М. После тщательного перемешивания смесл центрифугируют при 100009 в течение 20 мин, верхнюю полиэтиленгликолевую фазу, содержащую целевой продукт, собирают, разбавляют буфером, приливают гепаринсефарозу, предварительно уравновешенную 10 мМ трис-HCI, рН 7,2 и этой суспензией набивают колонку (нанесение в

"объеме"), проводят элюцию белков линейным градиентом концентрации NaCI îò 0 до

0,6 М в буфере. Фракции, содержащие эндонуклеазу ХЬа I собирают и концентрируют диализом против 50%-ного раствора глицерина в буфере.

Выход фермента из 10 г клеток составляет 120 — 150 тыс,ед.акт. Хранится препарат при -20(+2) Ñ в течение 6 мес без снижения активности. Свободен от значительных примесей неспецифических эндонуклеаз: обра1634713 ботка ДНК фага Т7 50-кратным избытком фермента в течение 20 ч (1000-кратный избыток) при 37 С не изменяет специфической картины гидролиза.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами, Пример 1, Все операции по очистке фермента проводят при 4 4 C.

Активность рестриктазы ХЬа I тестируют методом гидролиэа ДНК фага Т7 с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в 0,8 -ном агарозном геле. 3а единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для постоянного специфического гидролиза 1 мкг ДН К фага Т7 в течение

1ч37ч-1 С.

10 г замороженной биомассы Х.badril

ВКПМ В-2754 суспендируют в 20 мл 10 мМ трис-HCI, рН 7,9, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,01 М 2-меркаптоэтанола, добавляют тритон Х-100 до конечной концентрации

0,1% и обрабатывают ультразвуком при частоте 20 кГц и амплитуде 17+ 2 мкм несколько раэ до исчезновения вязкости в биомассе, периодически охлаждая смесь для предотвращения нагревания смеси и инэктивации фермента. К клеточному гомогенату при постоянном перемешивании приливают 30 мл смеси, содержащей 21 полиэтиленгликоля и 6 декстрана, 7,88 мл

4М раствора NaCI (до конечной концентрации последних; полиэтиленгликоля 7, декстрана 2, NaCI 0,35 М) и 22,12 мл деиониэованной воды.

Смесь продолжают перемешивать в течение 20 мин, затем центрифугируют при

10000 об/мин в течение 20 мин. Верхнюю фазу отбирают, разбавляют в 2 раза буфером 10 мМ трис-HCI, рН 7,2, содержащим 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА и 10 глицерина (буфер А) и добавляют туда же 10 мл гепарин-сефарозы, предварительно уравновешенной буфером А.Смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 20 мин и набивают в колонку (2,0 X15 GM). Колонку промывают 100 мл 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, содержащим 10 MM 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА и 10 глицерина (буфер

Б), фермент элюируют линейным градиентом концентрации NaCI от 0 до 0,6 M e буфере Б. Общий объем градиента 100 мл, Скорость нанесения, промывки и элюции 15 мл/ч. Собирают фракции объемом по 3 мл и анализируют на активность ретриктазы

ХЬа I. Фракции, содержащие целевой продукт, которые элюируюТся в диапазоне кон5

55 цент рации Na CI 0,3-0,4 М, объединяют (ч = 15 мл), переносят в диализный мешок и диализуют против 200 мл 50 -ного глицерина в

10 мМ трис-HCI, рН 7,4, содержащим 0,1 мМ

ЭДТА 0,5 М KCI, 0,01 M 2-меркаптоэтанола (буфер С), Время диализа 14 — 17 ч.

Выход фермента составляет 120 тыс. ед. аКТ. Концентрация фермента 24000 ед. акт,/мл, Полученный препарат эндонуклеазы рестрикции Xba хранят при -20 С в течение б мес без снижения активности. Содержание примесей неспецифических нуклеаз в препарате оценивали двумя способами: обработкой ДНК фага 17 избытками фермента в течение длительного времени и методом рестрикция-легиравание-повторная рестрикция, Установлено, что при обработке 1 мкг ДНК фага Т7 50 ед.акт. препарата рестриктазы Xba в течение 20 ч при 37 С не изменяется четкая специфическая картина гидролиза. Фрагменты, получаемые при обработке 1 мкг ДНК фага Т7 30 ед, акт препарата Xba в течение 17 ч при 37 С. лигируются ДНК-лигэзой фага Т4 не менее чем на 90 и полностью специфически гидролизуются при обработке препаратом Xba I.

Пример 2, Эндонуклеазу рестрикции

ХЬа выделяют из 10 г клеток аналогично примеру 1 за исключением того, что к клеточному гомогенату приливают 9,45 мл 4 М

NaCI (до конечной концентрации 0,42 М) и

20,55 мл деионизованной воды.

Примеси неспецифических эндонуклеаз и фосфатаз в препарате не обнаруживаются.

Формула изобретения

Способ получения эндонуклеазы рестрикции Xba I, предусматривающий разрушение клеток продуцента Xanthomonas

badrii ультразвуком, фракционирование клеточного гомогената в двухфазной системе, содержащей 7 полиэтиленгликоля и

2 декстрана, в присутствии NaCI, хроматографическую очистку нэ сорбенте, уравновешенном буфером, и диализ против

50%-ного раствора глицерина, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения процесса с одновременным повышением выхода и качества целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм

Xanthomonas badrli ВКПМ-2754, фракционирование клеточного гомогената проводят в присутствии 0,35-0,42 М NaCI, хроматогрэфическую очистку фермента осуществляют на гепаринсефарозе, уравновешенной

10 мМ трис-НС! буфером рН 7,2.