Способ получения иммуностимулятора

 

Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и касается способа получения иммуностимулятора пролонгированного действия на основе пептидгликана, выделяемого из клеточных стенок бактерий. Цель изобретения - повышение удельной активности и увеличение продолжительности действия. Для этого выделяют пептидгликан Lactobacillus bulgaricus , подвергают его ультрафильтрации на мембранах с минимально удерживаемой мол. м. 5000-10000 и отработке водным раствором сополимера М-винилпирролидона с акролеином при массовом соотношении пептидгликан - полимер 1:(1-3) с последующим сублимированием. Ј

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 5

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4300673/13 (22) 27.08.87 (46) 28.02.91. Бюл. № 8 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов (72) Н. В. Беляков, А. А. Прокопьев, Е. Н. Минаева, М. А. Самарцев и С. А. Кетлинский (53) 612.083(088.8) (56) О. В. Галкина и др. Состав и биологическое действие препарата из клеточных стенок Lactobacil !us bulgaricus 1 В-51.— Биотехнология, 1986, № 1, с. 101 — 109.

Авторское свидетельство СССР № 143978, кл. А 61 К 35/74, 1987.

Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и касается способа получения иммуностимулятора пролонгированного действия на основе пептидгликана, выделяемого из клеточных стенок бактерий.

Целью изобретения является повышение удельной активности и увеличение продолжительности действия.

Пример 1. Получение модифицированного иммуностимулятора.

В качестве исходного сополимера используют совиаль — сополимер винилпирролидона с диэтилацеталем акролеина, который превращают в сополимер со свободными альдегидными группами следующим образом. Раствор 1,8 г совиаля в 80 мл 0,01М соляной кислоты в течение 2 ч нагревают на кипящей водяной бане. Полученный раствор охлаждают и нейтрализуют 4 М едким

ЛК„1630830 А 1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА (57) Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и касается способа получения иммуностимулятора пролонгированного действия на основе пептидгликана, выделяемого из клеточных стенок бактерий. Цель изобретения — повышение удельной активности и увеличение продолжительности действия. Для этого выделяют пептидгликан Lactobaci1 1 us bu lgaricus, подвергают его ультрафильтрации на мембранах с минимально удерживаемой мол. м. 5000 — 10000 и отработке водным раствором сополимера N-винилпирролидона с акролеином при массовом соотношении пептидгликан — полимер 1:(1 — 3) с последующим сублимированием. натром до рН 7,5 — 8,5, после чего к нему добавляют 0,1 М боратный буфер с рН 8,5—

9,5 до объема 180 мл. К 7 мл полученного раствора (что соответствует 70 мл исходного сополимера) добавляют 40 мг лиофильно высушенного препарата пептидгликана. Раствор выдерживают в течение 2 — 4 ч при комнатной температуре, после чего добавляют

10 мг боргидрида натрия и через 1 час концентрируют раствор до объема 3 мм, промывают двукратно 10 мл воды. Раствор лиофильно высушивают и определяют содержание пептидгликана в сухом препарате по аминокислотному анализу.

Примеры 2 — 4. Следующие образцы модифицированного иммуностимулятора получают аналогично примеру 1 при измененных соотношениях исходных реагентов и различных способах нейтрализации альдегидных групп, как это показано в табл. 1.

1630830

Формула изобретения

Таблица 1

Количество ис- Количество

Нейтрализация альдегидных групп

Пример ходного совиаля, мг исходного пептидгликана, мг

Реагент Количество, мг

70

Этанол- 30 амин

Боргидрид натрия трет;Бутиламин

300

800

50

150

Пример 5. Получение модифицированного стимулятора с пониженным содержанием белка.

Препарат пептидгликана растворяют в воде до концентрации 2,3 мг/мл (оптическая плотность при 280 нм 1,2) и фильтруют раствор через мембрану РМ-! 0 с минимально удерживаемой мол. мас. 10000. Оптическая плотность фильтрата, содержащего пептидгликан, 0,05, т. е. практически весь белок остается в концентрате над мембраной.

К 20 мл полученного фильтрата добавляют 30 мл раствора гидролизованного сополимера (концентрация 3 мг/мл) и выдерживают 2 ч при комнатной температуре.

Затем добавляют 20 мг солянокислого гидроксиламина и через 1 ч концентрируют раствор с использованием мембраны РМ-10, концентрат подвергают лиофилизации.

При,чер б. Определение иммуностимулирующей активности образцов.

Определение проводят на мышах-гибридах F (СВАхС57/BL). Образцы препаратов вводят однократно внутривенно в дозах 5,0 и 0,5 мг на 1 кг веса животного в 0,5 мл стерильного физраствора. Животным контрольных групп вводят эквивалентное количество растворителя. Число антителообразующих клеток селезенки (АОК) оценивают методом локального гемолиза на пятые сутки после иммунизации мышей эритроцитаМи барана в дозе 10 клеток на мышь. Достоверность различий оценивают по критерию t Фишера i ьюдента.

Результаты исследования приведены в гибл. 2.

Из данных, представленных в табл. 2, видно, что при использовании иммуностимулятора, полученного по предлагаемому способу, для достижения эффекта, получаемого при использовании известного способа, требуются меньшие дозы (в 10 раз).

Пример 7. Оценка иммуностимулирующей активности по индукции интерлейкина-2.

Адъювантное действие известных иммуностимуляторов связано с их способностью вызывать индукцию образования интерлейкина-1 клетками моноцитарного ряда и ин. терлейкина-2 (ИЛ-2) Т-клетками. Поэтому в качестве тест-системы для сравнительного изучения иммуностимулирующей активности препарата, полученного по предлагаемому способу, используют также анализ уровней

ИЛ-2 после введения препарата животным.

Препараты вводят животным внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг. Через 1, 3, 5 и 10 сут клетки селезенок мышей эксплантируют «ин витро» и исследуют продукцию ИЛ-2 в ответ на конканавалин А (КонА) (1 мкг/мл).

15 Результаты исследований приведены в табл. 3.

Из данных, приведенных в табл. 3, видно, что введение препарата вызывает гиперпродукци1о ИЛ-2 селезеночными клетками мы20 ши. При этом ИЛ-2 — индуцирующее действие пептидгликана по известному способу проявляется через 5 сут, но практически прекращается через 10 сут, в то время как введение препарата, полученного по предлагаемому способу, приводит к сохранению эффекта в течение 10 сут, т. е. к пролонгированному действию.

Способ получения иммуностимулятора, включающий выделение пептидгликана Lactobacillus bulgaricus LB-51 с последующим сублимированием, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности и увеличения продолжительности действия, перед сублимированием пептидгликан подвергают ультрафильтрации на мембранах с минимально удерживаемой мол. м. 5000—

10000 д и обработке водным раствором сополимера N-винилпирролидона с акролеином при массовом ссютношении пептидгликан — полимер 1:1 — 3.

1630830

Таблица 2

Стимуляция, 7

Количества

АОК на 10

Препарат

Доза, мг/кг клеток селезенки

Контроль (физраствор)

Пептидгликан по известному способу

152+7!! !! !1

Таблица 3

Включение Н-тимидина клетками CTLL (срм)

11репарат для инъекции

1 1

10 сут P

5 сут P

7670+1050

52101590

0,01 8100+1240

0 01 13200+1330

9800+1В160

11090+1780

0,01

Составитель С. Пылова

Редактор Л. Веселовская Техред+,Êðàâ÷óê Корректор С. Шевкуп

Заказ 511 Тираж 449 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат «Патент», г. Ужгород, ул. Гагарина, !О1

По примеру 1

То же

Контроль (физраствор)

По примеру 2

По примеру 3

По примеру 4

Контроль (физраствор)

Пептидгликан по известному способу

По примеру 1

5,0

0,5

5,0

0,5

0,5

0,5

0,5

323+30

208+26

470+15

303+26

176+25

342+20

303+26

112

37

209

124

94