Штамм бактерий viвriо сноlеrае сноlеrае ogawa, используемый для получения холерного токсина

 

Изобретение относится к медицинской микройнологии, а именно к получению штамма xo.iepHoro вибриона классического биспира серовара Огпва, продуцирующего холерный токсин во внешнюю среду. Цель изобретения - конструирование нового штамма ссроваря Ogavva, способного продуцировать спец.(|фическнй холерный экзотоксин в высоких концентрациях (до 12 мг/л). Штамм полу чен путем конъюгационного переноса коннтегратной плазмиды рС0107-2. содержащей клонированиые |-ены токсигенности (vct-rcHbi), от клеток ита.мма Е. соП P3-t78 pCOi07-2 клеткам штамма V. cholerae cholerae RV3I и последующего слбора клонов с .мплифицированнымн теи;;мн токсигеннооти. Депониропан в коллгкиии Института «.Микроб под ипмс(юм КА 75/рС0107-2. Штамм может быть яcIlo.ч..(Jвaн для получения специфического холерного эндотоксина, который используют для но.чуюикя вакцины 1 табл. и монс)специфн геско1 | сыво 1огкн. о (Л

СОЮЗ СОВЕТСИИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АBTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

1(46) 30. 08. 90. 1; ! 32 (2I) 4160203/28-13 (22) 08,12,86 (7 I ) Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» и Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н. Ф. Гамалеи (72) Н. И. Смирнова, Л. Ф. Ливанова, А. Л. Гинцбург,.Н. В. Янишевский, Ю. В. Вертиев и T. С. Ильина (53) 576.8.097 (088.8) (56) Markel D. F., I)ejtmancik К. E., Ре!erson 1. %. et. а!. «Сharacterization ot (11е antigenic determinants of сЛо!ега toxin subunits»

J. Infect. Immun., 1979, ч. 25г 2, р. 615 — 626.

Mekalanos I. 1. «Duplication and amplification of toxin genes in Vibri Cholerae»

I. Cell., 1983, v. 35. I, р. 253 — 263. ,Джапаридзе М. 11., Кара> ва Л. П., Cумлроков А. А и др. Оральная химическая вакцина из токгнгенного штамма V. cholerae— серовара Огава. ЖМЭИ, 1979, 10, с. 62 — 68..SU 1400075 А 1 (51) > С 12 !х! 15/00, А 61 К 35/74 // (С 12 )х! 15 00, С 12 Я 1 63 (54) IИТАММ БАКТЕРИИ VIBRIO CHOLF RAE СНОг ЕКАЕ OGA WA, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕРНОНО ТОКСИНА (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к получению штамма холерного вибриона классического биовнра серовара Огава, продуцируюгцего холерный токсин но внешнюю среду. (1ель изобретения — конструиронание нового штамма ссровара Ogaii а, способного продуцировать специфический холерный зкзотоксин в высоких концентрациях (до 12 мг/л). Штамм получен путем кон ьюгационного переноса коинтегратной плазмиды рС0107-2, содержащей клон ирона Híûå гены токси геI! noc Tn (vct-гены), от клеTÎK штамма Е. coli Р3478

pC0i07-2 клеткам штал1ма V. с!1о1егас cholerae RV31 и последук>снего отбора клонов г емплифицированными тен;.мн токсигеино..Tè. Депоннрован н коллекции Института

«Микпоб» под нт>мс1>ом КМ75/рС0107-2.

11!тамм может быть исволь ован для получения специфического холерного эндотоксина, который используог для полу.>cHHR вакцины и моноспсцифнческ:.й сыворотки. табл.

1400075

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к получению штамма холерного вибриона классического биовара серовара Огава, продуцирующего холерный токсин во внешнюю среду.

1Гелью изобретения является конструирование нового штамма серовара Ogawa, способного продуцировать специфический холерный экзотоксин в высоких концентрациях.

Штамм Ч. cholerae cholerae содержит гибридную плазмиду рС0107-2, детерминирующую синтез холерного токсина. Штамм

Ч. со!егае cholerae КМ75 получен путем коньюгативного введения в клетки Гипотоксигенного штамма V. cholerae cholerae РЧ

31 ilv arg his Str серовара Огава гибридной плазмиды pCOI07-2, содержащей vct-оперон, детерминирующий синтез холерного токсина.

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Института «Микроб» под номером КМ 75/pC0107-2 и характеризуется следующими признаками.

Культурно-морфологические признаки.

Подвижные, слегка изогнутые палочки, спор и капсул не образуют, грамотрицател ьн ые.

Штамм растет как на простых полноценных средах, так и на средах с добавлением

5 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл канамицина. На твердых питательных средах формирует гладкие, круглые серовато-голубоватые полупрозрачные колонии размером

1,0 — 1,5 мм.

Вызывает равномерное помутнение как простых жидких питательных сред, так и сред с добавлением антибиотиков, через 18—

24 ч не образует пленки на поверхности бульона.

При выращивания на минимальной среде необходимо добавление изолейцина, валина, аргииина и гистидина.

Физиологические своиства.

Ферментирует до кислоты без газа маннозу, сахарозу, маннит и мальтоэу. Не ферментирует лактозу и арабннозу. Не лизирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты, не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкм/мл полимиксина.

Чувствителен к холерному диагностическому фагу С.

Агглютинируется до титра холерными сыворотками О (1:2000) и Огава (1:800) .

Патогенные свойства.

Вирулентен для кроликов-сосунков в дозе ! 0 м. кл. / мл.

Пример. Высушенную ампульную культуру штамма Ч. cholerae cholerae КМ75 засевают на агар Хоттингера рН 7,6, содержащий 5 мкг/мл тетрациклина или 50 мкг/мл канамицина, и инкубируют 18 ч при 37 С.

Для количественного определения холерного экзотоксииа используют иммуноферментный метод amiFLISA. В качестве контрол я и для on ределен и я чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина. Клетки штамма КМ 75 в объеме 10 мл выращивают 18 ч при 30 С в 0,1-литровых колбах в среде, содержащей

Зо казаминовых кислот и 0,5О дрожжевого экстракта при рН 7,6.

Клетки осаждают центрифугированием, в супернатанте определяют экзотоксин. Пробы инкубируют в течение часа с сенсибнли10 зирован ной га игл иозидами поверхностью лунок микроплат. Инкубацию с антитокснческой противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, проводят в течение 18 ч при

15 комнатной температуре. После промывания

0,05 М фосфатным буфером рН 7,2 в лунки добавляют по 0,2 мл раствора иммуноферментных конъюгатов в разведении 1:150.

Конъюгаты состоят из А-белка стафилококка и пероксидазы. Реакцию учитывают через

30 мин после добавления субстрата го

0,003О перекиси водорода в 0,15 М NaCI и и-фениленднамина. Чувствительность метода am ELISA составляет в данной серии опытов I нг/мл. В соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа выросших в процессе культивирования микробных клеток рассчитывают количество продуцируемого холерного токсина у исследуемого штамма КМ75. Штамм Ч. cholerae

30 RV31 продуцирует 0,0002 мг токсина на 1 л культурального фильтрата, а штамм V, cholerae КМ75, содержащий плазмиду рС0107 2, — 12 мг токсина на л культурального фильтрата (таблица) .

35 Лля проверки способности штамма продуцировать экзотоксин методом пассивного иммунного гемолиза колонии штамма КМ75 переносят методом реплик на чашки с 1О синказным агаром, содержащим 1Я отмытых в синказном бульоне эритроцитов барана. В качестве контроля на эти же чашки помешают исходный штамм РЧ31, а также высокотоксигенный штамм V. cholerae cholerae 569(В) Инаба. Посевы выращивают

18 ч при 30 С, заливают слоем 0,5О син45

55 казного агара, содержащего азид натрия, комплемент морской свинки и монорецепторную антитоксическую сыворотку и помещают в термостат (37 С). Через 1 — 2 ч наблюдают зону лизиса эрнтроцитов вокруг макроколоний, продуцируюших токсин во внешнюю среду. Исходный штамм V. cholerae cholerae RV31 не продуцирует по этому методу из-за его более низкой чувствительности экзотоксин, поэтому зоны лнзиса эритроцитов вокруг макроколоний отсутсгвуют.

Наличие больших четких зон лизиса эритроцитов вокруг макроколоний штаммов

КМ75 и 569(В) свидетельствует об интенсивной продукции ими токсина.

1400075

Испытуемый препарат

Концентрация токсина, мг/л

Формула изобретения

Составитель Г. Смирнова

Резактоо Л. Павлова Техред И. Верес Корректор Г. Решетник

Зака з 3091 Тираж 510 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1I3035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Пр: нзводственио-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Определение продукции холерного токсина методом om, ELlSA

Фильтрат:

1. Ч. с h о1er а е 569 В 8,5

2. Ч. cholerae КМ75/рС0107-2 12.0

3. Ч. cholerae RV31 0,0002

Полученные в лабораторных условиях пробы экэотокснна, прсдуцируемого штаммом КМ75, испытывают на наличие холерогенного эффекта на крольчатах-сосунках по методу Д,атта н Хаббу 10 — 12-дневным крольчатам весом 130 — 160 г внутрнкишечно вводят I мл экзотоксина. Контролем служит среда выращивания штамма Vibrio cholerae

cholerae КМ75/рС0107-2. Учет результатов проводят через 24 — 48 ч. Положительный

4 холерогенный.эффект наблюдают лишь при введении исследуемого экзотоксина.

Таким образом; сконструированный штамм Ч. сто!егае cholerae КМ75/рС0107-2 сероаара Огава продуцирует специфический холерный экэотоксин, секретируемый во внешнюю среду, н может быть использован в качестве производственного штамма для получения холерной вакцины холерогенанатоксин, а также синтетических вакцйн, применяемых для профилактики холеры, вызываемой вибрионом. Кроме того, он может быть использован как продуцент холерного экэотоксина, применяемого для получения моноспецифнческой сыворотки.

Штамм бактерий Vibrio cholerae cholerae

0gawa, КМ75/рС0107-2, используемый для получения холерного токсина.