Штамм вируса гепатита а для приготовления диагностических препаратов

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и представляет собой новый штамм вируса гепатита А (ВГА) (МИ-1 и его термовариант М-1,1). Целью изобретения является повышение технологичности штамма ВГА. Штамм адаптирован к продукции в перевиваемых клеточных линиях PLC/PRF/5 и МК, при 32 и 37°С пригоден для изготовления антигена, необходимого для получения диагностических препаратов, которые могут успешно применяться для лабораторной диагностики больных ГА, изучения иммунитета в серологических реакциях, в эпидемиологической практике и для идентификации вновь выделяемых вирусов гепатита А. Штамм МИ-1 зарегистрирован в Государственной коллекции вирусов ГКВ-801) и отличается от известных штаммов по спектру размножения в культуре клеток. 2 табл.

союз совЕтсних социАлистичесних

РЕСПУБЛИК (19) (И) А1 (S>)S С 12 Б 7/00.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРИЧНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ по иэбБРетениям и DTHpbjTHRM пРи гкйт сссР (21) 4617829/30-13 (22) 09.12.88 (46) 15.11.90. Бюл. В 42 (71) Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского (72) В.Р.Фарашян, А.Б.Быченко, И.А.Кузаева, Е.К.Артемов, M.Î.Ôàâoðîâ, и 10.П.Кадошников (53) 576.8.,094(088.8) е (56) Bradley D.Н., Schahle С.A. et а1.

I.Med„ Virology, 1984, v. 14, р.560.

Siegl G. Chastonay I. dе Kronauer G.I. Virol. Net ° 1984, v. 9, р. 53. (54) ШТАММ ВИРУСА ГЕПАТИТА А ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к медицинской вирусологии и представляет собой новый штамм вируса гепатита А (ВГА) Изобретение относится к медицинской вирусологии и представляет собой новый штамм вируса гепатита А (ВГА), пригодного для изготовления антигена, необходимого при изготовлении диагностических препаратов.

Цель: изобретения — получение двух термовариантов штамма ВГА.

Для этого в качестве источника антигена используют адаптированный штамм BIA (очищенный или из клеточного лизата), заражают им перевиваемые клеточные линии PLC(PRF)5 или

MII: и после трех недель выращивания вируса при 32 С в среде МЕМ с 2% эмбриональной сывороткой плодов коров клетки разрушают ультразвуком и анти2 (МИ-1 и его термовариант МИ-1,1), Целью изобретения является повышение технологичноети штамма ВГА. Штамм адаптирован к продукции в перевиваемых клеточных линиях PLC/PRP/5 и МК, при 32 и 37 С пригоден для изготовления антигена, необходимого для получения диагностических препаратов, которые могут успешно применяться для лабораторной диагностики больных

ГА, изучения иммунитета в серологичес" ких реакциях, в эпидемиологической практике и для идентификации вновь выделяемых вирусов гепатита А. Штамм

МИ-1 зарегистрирован в Государственной коллекции вирусов (ГКВ-801) и отличается от известных штаммов по спектру размножения в культуре клеток. 2 табл. ген ВГА после концентрации 6000 полиэтиленгликолем и очистки хлороформом может быть использован в диагностических препаратах.

Штамм МИ-1 и его термовариан1 .

МИ-1,1 получают пассированием в перевиваемой клеточной линии Р1.С(РРР)5 при 32 и 37 С исходного штамма, выделенного в межэпидемический период из фекалий взрослого больного гепатитом A(IOP)N в ИФА-10% экстракты фекалий, резко положительная

ИФА на IgN антитела к ВГА из сыворотки больного I A, Штамм обладает всеми признаками и характеристиками ВГА и хранится в Государственной Коллекции Вирусов

3

160653 лаборатории музейных штаммов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского

АМН СССР (кодовый номер ГКВ-801).

Штамм охарактеризован по следующим свойствам: вирусологическим, морфологическим, физико- симическим, серологическим и молекулярнобиологическим б

При адаптации штамма МИ от боль- !0 ного ГА используют клеточные линии

FRhK-4, РАМТ, JI3 1-240, PLC(PRF)5, Стабильной продукции ВГА данного штамма (МИ-1 и его термовариант

МИ-I,I) удается добиться в клеточной линии PLC(PRF)5 (гепатокарцинома человека) при 32 и 37ОС (табл.1), Содержание инфекционного материала штамма МИ-1 в культуре на четвертом пассаже составляет 10 ИЕ/мл, на пятом пассаже I G ИЕ/мл, на шестом пассаже 10 ИЕ/мл.

Физико-химические свойства. При скоростном ультрацентрифугировании в 10-30%-ном сахарозном градиенте у штамма NH 1 и его термоварианте

МИ-I,I отмечают 2 пика антигенного материала (ИФА):1-й (8-15 фракции) быстрее седиментирующий, соответствует полноценным вирусным части- 30 цам (150$) и 2-ой {16-18 фракции) дефектным вирусным частицам без нуклеиновых кислот — 90S(12).

В СзС1 градиенте плавучая плотность полноценного вируса соответ- 35 ствует плотности 1,33 г/см

Морфологические признаки. При негативном контрастировании диаметр очищенных вирусных частиц рекомендуемого штамма колеблется в преде- 40 лах 27-28 нм, Частицы построены по тяпу кубической симметрии, имеют сходство с мелкими PHK-содержащими вирусами и не отличаются от прототипного зарубежного штамма NBB 11/5. 45

Белковый электрофорез.

При электрофорезе вирусных белков

I штамма видны 3 структурных белка

VP-1, VP-2, VP-3.

Изобретение иллюстрируется следую- 50 щими примерами.

Пример 1. Использование штамма МИ-1 в ИФА для выявления IgM антител к ВГА в сыворотках больных

ГА. 55

Схема постановки реакции. Анти- !ч (антитела к IgN антителам человека) адсорбируют на подложку 96-луночной плашки. Далее в лунки нано3

4 сят исследуемую сыворотку (разведение 1:1000). ?дМ антитела человека иммунологически связывают с анти-!ц, Далее в лунки наносят АГ BI A который иммунологически связывается с

IgN антител больных 1 A. Далее в лунки вносят коньюгат (IgG антител к

ВГА, меченные пероксидазой) . Реакция проявляется субстратом ортофенилендиамином.

Сравнительный анализ на выявляемость IgN к ВГА в сыворотках больных ГА с помощью АГ ВГА от рекомендуемого штамма МИ-1 и штамма МВВ 11/5 на 220 положительных сыворотках (IgN к ВГА) в 92%. случаев (202 сыворотки) показал одинаковый результат. 1!!таммом МИ-1 выявляют IgM в,213 сыворотках (97%), а прототипным штаммом

MBB I1/5 — 209 сыворотках (95%), Расхождение в резул татах анализов составляет 3-5%.

Гибридизационный анализ.

Для доказательства родства штамма

NH-1 к.вирусам гепатита А гибридязационным анализом используют 32

P-кДНК-ВГА из банка последовательностей штамма MBB 11/5{ФРГ). Все

32 Р-кДНК-ВГА последовательности гибридизуют с вирусной PHK штамма

МИ-1 в зараженных клетках и не гибридизуются с нуклеиновыми кислотами не зараженных клеток.

Гибридизационные данные подтверждают принадлежность к вирусам гепатита А штамма МИ-1. В то же время наличие биологических отличий (спектр размножения штамма МИ-1 в культурах клеток) от известных штаммов гредб полагает отличие и в первичной последовательности, что и обуславливает уникальность рекомендуемого штамма.

Пример 2, Продукция вируса гепатита А штамма MH-1 в перевиваемой клеточной линии PLC(PRF)5, В опытах по синтезу вирусной PHK (точечная гибридизация) и белков с образованием антигена ВГА (ИФА) видно, что максимум синтеза в PHK и обг разование антигена достигает максимума для штамма МИ-1 к 3-7 дню после заражения, а для известного штамма

MR-61 к 7-14 дню.

Урожай штамма с 1 л культурально-

ro матраса аа 3 недели роста после заражения составляет 1000-2000 доз.

Пример 3. Сравнительная характеристика штамма MH-1 и его

1606533 термоварианта МИ-1,1 по репродукции в клеточных линиях с известными штаммами из различных регионов мира (табл.2).

При проведении сравнительного анализа продукции ВГА в различных клеточных линиях штамма с известными виден характерный спектр размножения штамма МИ-1 и его термоварианШтамм вируса гепатита А ГКВ Ð 801 для приготовления диагностических препаратов, Таблица 1

Адаптация и репродукция штамма МИ в различных клеточных линиях (по АГ ВГА в ИФА) Вариант штамма

Пассаж, Ф

2 3 ) 4 (Температура, С

Клетки

1 Г

37

37

37

37

2,0

2,0

2,5

6,0

3,4

2,0

3,6

3,5

3,2

3,8

FRhK-4

РАМТ

ЛЭЧ-240

Р1.С (PRF) 5

РТ С (РКР) 5

2,0

11,0

11,0

11,0

11,0

МИ-1, 1

МИ-1

11,0

11,0

Таблица 2

Сравнительная характеристика штамма МИ-1 и его термоварианта

МИ-1,1 по продукции АГ ВГА в клеточных линиях с известными штаммами ВГА из различных регионов мира

Происхож. Темпера- Клеточная линия (АГ ВГА, ИФА) дение тура, С (страна) PLC(PRF)5 ЛЭЧ-240 FRhK-4 MK

М - Штамм не де нед е

+

++

++ над ° н,д. н,д.

9а МИ-1.

9б МИ-1, 1

32

++ н,да н.д.

П р и м е ч а н и е. — О/К 2, + — О/К с3, + 0K(10, ++ О/К в ИФА, штаммы адаптированы к данной линии клеток. Штаммы

CF-979, KMM-1, СВМ, Н-141 адаптированы к линии МРС-5.

Составитель И.Тареева

Редактор Н.Киштулинец Техред М.Ходанич Корректор Л.Патай

Заказ 3528 Тираж 482 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,101

1 НА$-15

2 CF-979

3 IH-26

4 MR-61

5 KMM-1

6 GEM

7. H-141

8 МВВ 11/5США

C1ilA

ГДР

ГДР

1Пвейцария

ФРГ

Индия

Северная

Африка

СССР

СССР

37

37

37

37

32

32

32

32 та MH-1,1 в клеточных линиях (PI.Ñ (PRF) 5 и MK) .

По спектру размножения в клеточ5 ных линиях штамма МИ-1 и его термо- вариант отличается от известных, Формула и э обретения

++

++

++

++

++5