Штамм ротавируса мышей, для получения диагностических препаратов

 

Изобретение относится к вирусологии. Цель изобретения - штамм ротавируса мышей, пригодный для получения специфических диагностических препаратов. Штамм получил название ЕДС и депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.Д.И.Ивановского под номером ГКВ N2113. Штамм используют в качестве ротавирусного антигена для иммунизации животных, а также как вирусспецифический диагностикум для иммунологических реакций.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4481846/30-13 (22) 21.07.88 (46) 15.06.90. Бюл. М 22 (75) А.Д.Майборода (53) 576.858 (088.8) (56) Шустрова И.Е.,Ермолаева С.Н. Вирусная диарея новорожденных мышей, Методическое письмо, М., 1971, с. 8.

Крухтанова Т,А. Изучение некоторых вирусных инфекций лабораторных животных и разработка методов их выявления..Дисс. канд, мед. наук, М., 1974.

Изобретение относится к области вирусологии.

Целью изобретения является штамм ротавируса мышей, пригодный для получения специфических диагностических препаратов.

Штамм ротавируса мышей выделен от больных инбредных 7-12-дневных мышейсосунов линии BAL В/с из кишечника, селезенки и печени во время вспышки эпиэоотической диареи молодых мышей (Е01М) в питомнике лабораторных животных в 1983 г. Выделенный штамм получил наименование EDC — по первым двум буквам названия болезни EDIM и символа С, указывающего на линию мышей BAL В/с, ставшую источником выделения вируса.

Штамм прошел в лаборатории 21 пассаж через организм 5-7-дневных мышей линии ВА1 В/с.

„„5U„„1571066 А1 (54) ШТАММ РОТАВИРУСА МЫШЕЙ ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к вирусологии.

Цель изобретения — штамм ротавируса мышей, пригодный для получения специфических диагностических препаратов. Штамм получил название ЕДС и депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ N. 2113. Штамм используют в качестве ротавирусного антигена для иммунизации животных, а также как вирусспецифический диагностикум для иммунологических реакций.

Штамм EDC ротавируса мышей депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.

Д.И.Ивановского под номером ГКВ М 2113.

Штамм EDC ротавируса мышей характеризуется следующими признаками.

Физико-химические свойства. Вирус является PHK-содержащим. Устойчив к воздействию этилового эфира при 4-5 С в течение 20 ч, хлороформа при 18-20 С в течение 1 ч, дезоксихолата натрия в концентрации 1:500 при 37+1 С в течение 1 ч, фреона 113 при 18-20 С в течение 1 ч, тоипсина 0,25 -ного при 37 1 С в течение 2 ч.

Устойчивость к жирорастворителям свидетельствует о том,что вирус не содержит липидосодержащей оболочки. Вирус не ингибируется средами со значениями рН

2,5-12,0 при 4-50С в течение 2,5 ч. Термоустойчив к прогреванию при 37-60 С в течение 1 ч и в присутствии 1 М МоС!г при 50 С

1571066 в течение 1 ч, при 70ОС в течение 30 мин.

Вирус устойчив к глутаровому альдегиду в

0,3-0,5%-ной концентрации при 22-23ОC в течение 4 ч. Вирус инактивируется при использовании 0,5%-ного раствора глутарового альдегида через 24 ч и 1%-ного раствора и через 0,5 ч.

Биологические свойства, Патогенен для животных, вызывает инфекцию у нелинейных и линейных 2-10-дневных мышей-сосунов линий BAL В/с, А/Sn, СВА и гибридов

FI (СВАхС57В1 /6) при пероральном заражении. Инкубационный период 1,5-3 сут, Признаки болезни у сосунов проявляются вздутием живота, переполнением желудка, острым энтеритом, некоторым замедлением роста, при осложнениях развиваются копростазы, приводящие к смерти животных от кишечной непроходимости.

Взрослые самки, вскармливающие больных сосунов, не имеют видимых изменений во внутренних органах, но являются вирусоносителями и у них обнаруживается вирусспецифический антиген в паренхиматозных органах.

Передача вируса. Вирус передается фекально-оральным путем.

Контагиозность, Вызываемое вирусом заболевание контагиозно для мышей.

Репродукционная способность. Вирус обладает высокой репродукционной активностью, Репродукция вируса, проходит в цитоплазме, Инфекционный титр вируса для мышей-сосунов при пеооральком заражении достигает 10 — 10 ИД 50/0,1 мл, Иммуногенность. Вызывает образование вирусспецифических антител, включая преципитирующих, при иммунизации кроликов и у мышей-реконвалесцентов.

Антигенные свойства. Выявляют антигенное родство штамма ЕОС ротавируса мышей с ротавирусами обезьян (штамм SA

II) и телят (штамм PM) при идентификации

его по непрямому методу иммукофлуоресценции (ИФ), в реакции диффузионной преципитации в агаре (РДПА) и по методу иммуноферментного анализа. Штамм EDC в испытаниях по ИФ не имеет связи с вирусами гепатита мышей, лимфоцитарного хориоменингита, осповакцины, эктромелии, Сендай.

На основании физико-химических, биологических и антигенных свойств выделенный штамм вируса классифицируют и относят к семейству Реовириде, роду Ротавирус.

Выявление свойства полученного штамма EDC в отношении его высокой устойчивости к повышенной температуре, липидорастворителям, изменениям РН среды в

55 широком диапазоне обеспечивают штамму способность выдерживать режимы обработки и очистки вируссодержащего материала от балластных белковых веществ и нежелательных контаминантов во время изготовления диагностических препаратов ротавирусного антигена, диагностикума и специфических сывороток, Пример 1. Получение энтигена и вирусспецифического диагностикума к ротавирусной диарее мышей.

Штамм EDC размножают путем заражания per os 5-7-дневных мышей линии BAL

В/с. Через 5-8 дней после инфицирования на высоте клинического проявления заболевания мышей забивают под эфирным наркозом; извлекают кишечник (и отдельно печень с селезенкой) и измельчают в гомогенизаторе или ступке, затем готовят 20%ную суспензию на физиологическом растворе с добавлением антибиотиков широкого спектра действия, например канамицина и гентамицина 100-200 ед/мл.

Суспензию выдерживают 2-2,5 ч при 4 С, центрифугируют при 3000 — 3500 об/мин в течение 30 мин и подвергают очистке фреоном. С этой целью вируссодержащую суспензию смешивают в равных объемных отношениях (1:1) с фреоном 113 и встряхивают на шуттель-аппарате в течение 1 5-2 ч при 20-25 Сдля извлечения фреоном изсуспензии балластных белковых веществ, Для последующей очистки суспензии и удаления фреона смесь центрифугируют при 3000—

3500 об/мин, После центрифугирования надосадочную жидкость контролируют на стерильность и используют в качестве ротавирусного антигена для иммунизации животных, а также как вирусспецифический диагностикум для иимунологической реакции диффузионной преципитации (РДПА).

Для иммунизации животных используют ротавирусный антиген, изготовленный из кишечника. Для иммунологических реакций в качестве диагностикума используют как суспензии кишечника, так и суспензии печени с селезенкой, обработанные по указанному способу.

В целях длительного сохранения ротавирусного диагностикума очищенную надосадочную жидкость соединяют с 4%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в объемном соотношении 1:1, разливают по 0,5 мл в вакуумные ампулы, подвергают вакуумной лиофильной сушке и используют в реакции диффузионной преципитации в агаре.

Пример 2, Получение гипериммунной диагностической сыворотки к штамму EDC ротавируса мышей.

1571066

25

35

50

Диагностическую сыворотку получают путем иммунизации кроликов очищенным ротавирусом мышей, полученным из суспенэии кишечника после обработки фреоном 113 в последовательности выполнения операций, как в примере 1. Для иммунизации используют кроликов породы шиншилла весом 2,5-3,0 кг.

Очищенный вирус смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и после получения эмульсии вводят кролику в область подколенного лимфоузла в объеме

1 мл и 1 мл в 10-12 точек внутрикожно в область спины. После 4- или 6-недельного перерыва проводят реиммуниэацию вирусом с неполным адъювантом в соотношении

1:1 в подколенную область в объеме 1 мл и

1 мл в 12-15 точек внутрикожно в область спины. Спустя 7-10 дней после реиммунизации производят забор крови из ушной вены кроликов.

Активность полученной из крови сыворотки определяют непрямым методом ИФ и в РДПА. При получении активных сывороток производят дробное кровопускание в сроки до 20-го дня после реиммунизации.

Титры специфических антител гипериммунной диагностической сыворотки в ИФ

1:64, преципитирующих антител в РДПА

1:32 — 1;64.

Пример 3. Обнаружение антигена (ротавируса мышей) в мазках-отпечатках из патологического материала непрямой иммунофлуоресценцией, Для исследования методом иммунофлуоресценции на обезжиренных предметных стеклах готовят мазки-отпечатки из кишечника, селезенки и печени инфицированных вирусом мышей. Препараты высушивают, фиксируют в ацетоне, наносят на них диагностическую гипериммунную кроличью сыворотку в рабочем разведении, помещают во влажную камеру, затем промывают фосфатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают. 3атем наносят флуоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика и обработку препарата повторяют указанными методом.

Приготовленные препараты исследуют в люминесцентном микроскопе. Положительным результатом исследования считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток на сероватом фоне свечения тканей органов. Исследование препаратов в ИФ сопровождается постановкой контролей с использованием гетерологичных и отрицательных сывороток, В качестве гетерологичных сывороток могут служить сыворотки против вируса гепатита мышей, Сендай, осповакцины, лимфоцитарного хориоменингита и др. Отрицательную сыворотку получают из крови здоровых мышей, С использованием гипериммунной сыворотки по методу иммунофлуоресценции проводят лабораторную диагностику ротавирусной диареи мышей во время вспышек кишечных заболеваний в питомниках и вивариях и при исследовании экспериментально зараженных животных, Пример 4, Определение антигена (ротавируса мышей) в патологическом материале и антител в сыворотках .крови с помощью реакции диффузионной преципитации в агаре.

Испытуемым материалом служат 5 ная суспензия кишечника, печени, селезенки или фекалий на фосфатно-буферном растворе от экспериментально зараженных и естественно больных мышей, а также сыворотки крови реконвалесцентов. Реакцию ставят в чашках Петри с агаровым покрытием, в котором делают лунки в виде звеньев, состоящих из 6 лунок по перифении и одной центральной в каждом звене.

Для обнаружения антигена ротавируса мышей в исследуемом материале в центральную лунку вносят диагностическую преципитирующую сыворотку в рабочем разведении, две диаметральные лунки заполняют заведомо положительным ротавирусным антигеном в рабочем разведении, в остальные вносят испытуемый материал, Для обнаружения антител в центральную лунку вносят вирусспецифический ротавирусный диагностикум, в верхнюю лунку наливают положительную преципитирующую сыворотку к ротавирусу мышей, в остальные вносят испытуемые сыворотки, Полученная специфическая диагностическая сыворотка при иммунопреципитации с антигеном ротавируса мышей, а ротавирусный диагностикум при взаимодействии с антителами к ротавирусу мышей вызывает образование линий преципитации в агаре, Проведенные в РДПА испытания дали

1 положительные результаты при исследовании мышей с экспериментальной и естественной ротавирусной инфекцией.

При сопоставлении результатов, полученных с помощью методов ИФ и РДПА, выявляют корреляцию данных. Метод РДПА уступает пс чувствительности тесту ИФ в 2-4 ра-.à, но более удобен при массовом контроле лабораторных животных, так как позволяет исследовать большее количество проб в единицу времени. Кроме того, установление этиологии заболевания с помощью метода РДПА проще в исполнении по сравнению с ИФ и может быть осуществле1571066

Составитель И.Тареева

Редактор О.Спесивых Техред М.Моргентал Корректор Н.Ревская

Заказ 1487 Тираж 478 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская нэб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 но на базе неспециализированной диагностической лаборатории практического профиля в непосредственной близости от очага инфекции.

Формула изобретения

Штамм ротавируса мышей ГКВ М 2113 для получения диагностических препаратов,