Штамм гриба rнizорus мiсrоsроrus-продуцент липазы

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению фермента липазы гидролизующего жиры. Цель изобретения - получение штамма гриба RHIZOPUS MICROSPORUS, обладающего высокой способностью к образованию липазы, специфичной к гидролизу рыбьего жира. Штамм RHIZOPUS MICROSPORUS ВКПМ F-377 (УзЛТ-2) получен адаптацией уже известного штамма RHIZOPUS MICROSPORUS УзЛТ-1 к гидролизу рыбьего жира. При культивировании в питательной среде, содержащей, (%): кукурузный экстракт 2, рыбий жир 1, водопроводная вода, PH 4,3-4,5, в аэробных условиях при 39-40°С в течение 18-24 ч культура образует высокоактивную липазу к гидролизу рыбьего жира с активностью 250 .10 4 е/л. а.с.в. биомассы достигает 15 г/л

удельная активность 0,595 .10 4 е/мг белка. Из культуральной жидкости липазу выделяют путем осаждения ацетоном, этанолом, изопропанолом 1:4. Препарат липазы, полученный из культуры, можно использовать для гидролиза рыбьих жиров при получении рыбопродуктов, обогащенных полиеновыми кислотами. Содержание эйкозопентановой кислоты достигает 20%, а диеновых кислот до 21,5%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

Я1)5 . С 12 N 9/20 1/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ. КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГКНТ. СССР (21) 4393263/31-1 3 (22) 16.03.88 (46) 30,07,90. Бюл. Р 28 (71) Институт микробиологии АН УЗССР (72) И.Г.Султанова и К.Д.Давранов (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР 467932 кл. С 12 N 9/20, 1973. (54) ITAMM ГРИБА RHIZOPUS MICROSPORUS — ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению фермента липазы, гидролиэующего жиры.

Цель изобретения — получение штамма гриба Rhizopus Miicrosporus, обладающего высокой способностью к образованию липаэы, специфичной к гидролиэу рыбьего жира. Штамм Rhizopus microsporus ВКПМ Г-377 (УзЛТ-2) получен адаптацией уже известного штамма RhiИзобретение относится к биотехнологии, в частности к получению липазы, гидролизующей рыбий жир с образованием полиеновых кислот, способствующих обогащению рыбных продуктов, используемой также для получения жирных кислот и переэтерификаторов на основе растительных масел и животных жиров, потребителями которых являются консервная, молочная и другие подотрасли пищевой промышленности, Цель изобретения — получение штам ма гриба Rhizopus microsporus, обладающего высокой способностью к образованию липаэы, специфичной к гидролиэу рыбьего жира.

„, Я0„„1581742 А 1

zopus miciosporus УэЛТ-1 к гидролизу рыбьего жира. При культивировании в питательной среде, содержащей, %: кукурузный экстракт 2, рыбий жир 1, водопроводная вода, рН 4,3-4,5, в аэробных условиях при 39-40 С в течение 18-24 ч культура образует высокоактивную липазу к гидролнзу рыбьего жира с активностью 250 10 е/л, а.с.в.

4 биомассы достигает 15 г/л. Удельная активность 0,595.10 е/мг белка. Из

9 культуральной жидкости липазу выделяют путем осаждения ацетонам, этанолом, изопропанолом 1:4. Препарат липазы, полученный из культуры, можно испольэовать для гидролиза рыбьих жиров при получении рыбапродуктав, обогащенных полиеновыми кислотами.

Содержание эйкоэапентановой кислоты достигает 20% а диеновых кислот до

21,5%. д

Штамм Rhizopus microsporus

QO ,ВКП11-F 377 (УзЛТ-2) получен адаптацией уже известного штамма Rh izopus mi crosporus УзЛТ-1 путем отбора колоний на агаризованной среде с кукурузным экстрактом (2%), содержащей в качестве единственного источника углерода рыбий жир. Проводили многократный пересев наиболее активных по липазе ф, вариантов на среде с возрастающим количеством рыбьего жира (от О, 1 до и

1,0%) .

Иорфолого-культуральные признаки штамма. На агаризованных питательных средах — сусло-агаре, среде с кукурузным экстрактом, культура хорошо

1581742 растет и образует колонии с пушистым белым воздушным мицелием, который .йосле двух суток покрывается серыми спорами.

Штамм имеет несептированный мицелий..При поверхностном культивировании споры образуются в шаровидных стилоспорангиях на прямых стилоспорангиеносцах. В глубинной культуре образуются хламидоспоры.

Культура бесцветная, пигментов не

Образует.

Оптимальная температура роста 3045 С, при 20 и 55 С рост отсутствует.

Хороший рост отмечается в диапазоне рН от 4,0 до 9,0. Оптимальная температура для биосинтеза липазы 39-40 С, рН 4,3-4,5, Физиолого-биохимические признаки.

Штамм слабо коагулирует молоко, xopomo растет на клетчатке и гидролизует крахмал.

В качестве источника углерода

Культура использует глюкозу, сахарозу, крахмал, галактозу, i-инозит °

Для биосинтеза липазы культурой необходимо наличие в среде индуктора— рыбьего жира, хлопкового, подсолнечного или оливкового масла.

Источниками азотного питания служат азотосодержащие компоненты пептона, дрожжевого автолизата, кукурузного экстракта.

Наилучший рост и биосинтез липазы происходит в среде с кукурузным экстрактом. Значительно слабее штамм растет в присутствии в среде неоргани ческих источников азота в виде/аммо= нийных и нитратных солей.

При культивировании в жидкой питательной среде с кукурузным экстрактом (2%) и рыбьим жиром (1%) при перемешивании и аэрации образуются активная эндо- и экзолипазы.

Культивирование штамма Rhizopus

microsparus (УзЛТ-2) BKHNF-377 на питательной среде, содержащей в качестве источника азота кукурузный экстракт, а в качестве источника углерода — рыбий жир при следующем соотнощении компонентов, %:

Кукурузный экстракт 2-3

Рыбий жир 1,0-1,1

Водопроводная вода Остальное обеспечивает увеличение ггипазной активности и продуктивности культуры.

Нйже приводятся данные по зависи-! мости роста и липазной активности культуры от компонентов среды.

Таким образом, оптимальной средой, как видно из табл., 1 и 2 является среда следующего состава, %:

Кукурузный экстракт 2

Рыбий жир 1

Вода .водопроводная Остальное

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1 (контрольный), Штамм

Rhizopus microsporus УзЛТ-2 культивируют в оптимальной среде, состоящей из кукурузного экстракта 2%, хлопкового масла 1,0%, водопроводной воды, рН 4,3-4 5. Температура культивирования 39-40 С. Липаэная активность куль о щ туры на указанной среде 209 10 Е/л культуральной среды, а абсолютно сухой вес (а.с.в.) биомассы в 1 л питательной среды 9,4 г,-Удельная активность внеклеточных липаз составляет

25 0,522 ° 10 Е/мг белка.

Пример 2. Колбы объемом

250 мл, содержащие 100 мл питательной среды следующего состава, %: кукурузный экстракт 2, рыбий жир i, водопроводная вода остальное, рН до стерилизации 4,3-4,5, стерилизуют при 1,0 атм в течение 20 глин, охлаждают до 35 С и засевают 2% посевным материалом.

Колбы с засеянной средой помещают на круговую качалку (210-230 об/мин) и продуцент культивируют при 39-40 С в течение 24 ч.

Липазная активность культуры в этих условиях 250.10 1 Е/л культуральной среды, а,с.в. биомассы достигает

15 г/л. Удельная активность внеклеточных липаз составляет 0,595 10 E/мг е белка.

45 Пример 3. В 30-литровый ферментер заливают 15 л питательной среды, состав которой указан в примере ,2,.стерилизуют в тех же условиях, охлажцают до 40 С, засевают 2% посевного материала и выдерживают при аэрации 1,0-1,2 л/л среды в 1 мин в течение 18 ч. Липазная активность культуры равна 250 10" Е/мг белка.

Сравнительная характеристика липа-, 55 эы исходного и адаптированного к рыбьему жиру штаммов Rhizopus microsporus представлена в табл. 3.

Как видно из предлагаемых примеров и табл.3, при культивировании штамма 5 1581742 6

Rhizopus microsporus УзЛТ-2 на пита- дуктов, обогащенных полиеновымн кис-. тельной среде с рыбьим жиром увеличи- лотами, содержание зйкозопентаеноной вается прирост биомассы более чем кислоты достигает.20%, а диеновых в 2. раза и липазная активность на кислот до 21„5%, рыбьем жире в 3 раза.

Испытание липазы из Rhizopus mic- Ф о р м у л а и з î б р е т е н и я

В rosporus УзЛТ-2 для гидролиза рыбьих жиров показало возможность применения Штамм гриба Rhizopus microsporus этого фермента при получении рыбопро- 10 БКПИ Г-377 - продуцент липазы.

Т а б л и ц а 1

Показатели

0 1 05 10 1,1 13

Биомасса, г а.с.в./л среды

Липазная активI ность р мп Ор 1 не е

K0H/100 мл культуральной жидкости 200

8 10 15 13 10

450 670 630 570

Таблица 2

Показатели

Концентрация, %

0,5 1,0 2,0 3,0 4,0

Биомасса, г а.с.в./л среды

Липазная актив- .. ность, мл 0,1 н.

КОН/100 мл культуалькой жидкости

7 .15

t5 14

150 340 670 620 535

Т а б л и ц а 3

Среда

Показатели

}Лтамм сходный Предлагаемый

Биомасса а.с.в./л на среде с хлопковым маслом

Биомасса а.с.в./л на среде с рыбьим жиром

Продуктивность, ед/л гм на среде

3 ° 1 ° с хлОпковым маслом

3,2, с рыбьим жиром

Липазная активность, %, на среде

4. 1. с оливковым маслом

4,2, с рыбьим жиром

10,5

9,4

15,.0

7 106

5,7 10

1,5 10

2,5.10. 65

147

100