Патент ссср 416958

 

о п и Ò изоы етения

4I6958

Союз Советских

Социалистических

Республик к патенту

Зависимый от патента №

Заявлено 02Х11.1969 (¹ 1344878/28-13)

Приоритет 02Х11.1968, № 45608/68, Япония

М. Кл. С 12d 13/10

Гасударственный камитет

Савета Иинистраа СССР иа делам нзааретений и аткрытий

УДК 577.15.07(088.8) Опубликовано 25.11.1974, Бюллетень М 7

Дата опубликоьания описания 06Л 111.1974

Авторы изобретения

Иностранцы

Дзинносуке Абе, Тецуо Ватанабе, Канго Мияути, Тосихару Нито, Цутому Ямагути и Нориюки Муроя (Япония) Иностранная фирма

«Тойо Джозо Кабусики Кайша» (Япония) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПАЗЫ

Изобретение относится к ферментной промышленности, а именно к способу получения липазы.

Известен способ получения липазы путем выращивания ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углеводов, азота и жиры, например оливковое, рапсовое, соевое масла, в присутствии минеральных солей с последующим выделением липазы из культуральной жидкости.

Предлагаемый способ позволяет расширить ассортимент применяемых продуцснтон.

Для этого в качестве продуцента используют бактерии рода Chromobacterium viscosu!« или Chromobacterium violaceum.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Бактерии Chromobacterium viscosum или

С hromobacterium violaceum выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и жиры в присутствии минеральных солей.

В качестве источников углерода могут быть использованы глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза, растворимый крахмал, обычный крахмал, декстрин, меласса.

В качестве источника азота может быть использовано любое подходящее азотсодержащее соединение, обычно используемое для этих целей, например измельченные соевые

s бобы, обезжиренная мука из соевых бобов, мука из хлопковых семян, пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, измельченные сухие дрожжи, мочевина, гидролизат казеина, соль аммония.

10 В качестве минеральных солей применяют соли ортофосфорной кислоты, например магниевые, кальциевые и калийные соли.

В питательную среду вводят как растительные, так и животные жиры, такие как оливко15 вое, соевое, хлопковое масла, свиное сало, говяжий жир, сливочное масло.

Жиры вводят в количестве равном 0,5 — 5% от веса культуральной среды.

Выращивание продуцента можно произво20 дить как поверхностным, так и глубинным методом, но целесообразнее использовать последний.

Выращивание осуществляют при температуре 24 — 28 С в течение 2 — 6 дней и при рН

25 6,0 — 7,0, установленном в начале процесса.

Выделение и очистку липазы производят обычным способом.

10

20

3

При использовании твердой среды липазу экстр агиру.ют водой.

При использовании жидкой среды из последней отделяют клетки, например фильтрованием под вакуумом или центрифугированием. !

1олученный таким образом фильтрат или экстракт конденсируют или в него вводят осадители ферментов, такие как хлористый натрий, сульфат аммония или органические растворители, например этанол, ацетон.

Фильтрат или конденсат можно высуши вать распылением после введения в них стабилизаторов, например мальтодекстрина, лактозы, карбоксиметилцеллюлозы, полиэтиленгликоля, снятого молока, казеина, сорбита.

Липаза, полученная предлагаемым способом, обладает стойкостью и активностью.

11осле выдерживания липазы при рН равном 4,0 — 9,0 в течение 24 час при температуре

20" С, остаточная активность ее составила

80%. Даже при pl-1 равном 3,0 — 10,0 остаточная активность липазы составляет не менее

70%.

Оптимальное действие липазы при рН paiaном 4,0 — 9,0 максимальное 6,0 — 7,0 при температуре 50" С.

1I р и м е р 1. В 100 мл стерильной жидкой питательной среды (рН 6,5), содержащей, %: свиного сала 2, крахмала 2, порошкообразных обезжиренных соевых бобов 2, (NH4)q $04

0,3, КН Р04 0,2, СаСО, 0,5, Nlg$04 7Н О

0,1, вносят Chromobacterium viscosum чаг par a I ip oIyti cum.

Культивирование осуществляют при 26 С в течение четырех дней при непрерывном перемеши.вании.

Затем отделяют мицелий и получают 75 мл фильтрата культуры.

Активность фильтрата, определяемая методом, при котором в качестве субстрата используют свиное сало, составляет 11,5 ед/мл.

I(фильграту добавляют этанол до достижения концентрации спиртового раствора 75%.

Таким образом, получили 3,43 r порошкообразной неочищенной липазы.

Пр и мер 2. Полностью повторяют процесс, описанный в примере 1, но из питательной среды исключают свиное сало. В результате получают 26 г липазы. (Титр — 15 ед r) .

Пример 3. В 20 л стерильной жидкой среды (рН 6,5), содержащей, %: свиного сала 2, порошкообразных обезжиренных соевых бобов

2) (NH4) $0„0,3, КН,Р04 0,2, СаСО 0,5, Мд$0, 7Н О 0,1 вводят 5 мл противопенного агента и засеивают микроорганизмами Chromobacterium viscosum var paralipoIyticum, предварительно культивируемыми в жидкой среде при 26 С в течение двух суток.

Процесс выращивания осуществляют при

26 С в течение четырех дней при аэрации со скоростью 20 л в 1 мин и перемешивании мешалкой со скоростью 300 об/мин.

4О

60 б5

Затем удаляют мицелий фильтрованием и получают 14,8 л фильтрата. Титр полученного фильтрата составляет 11,4 ед/мл.

К фильтрату добавляют 490 г мальтодекстрина и высушивают (температура на входе

120 С,;а выходе 70 С) .

Таким образом, получают 927 r неочищенной порошкообразной липазы, титр которой составляет 126 ед/г (определяют по методу, при котором в качеспве субстрата используют свиное сало).

Пример 3. Полностью повторяют процесс, описанный в примере 1, но в качестве продуцентов используют Chromobacterium viscosum

АТСС 6918 и Chromobacterium violaceum

ОТСС 12- 172.

Получают соответственно 1,3 г порошкообразной липазы с активностью 38 ед и 1,5 г с титром 35 ед!г.

Метод определения титра липазы.

Состав реакционной смеси, мл

Раствор фермента 1

Фосфатный буфер (0,1 моль) рН вЂ” 7,0 5

Эмульсия свиного сала 10

Эмульсию получают следующим образом:

20 г термически расплавленного сала добавляют к 10 мл «твина 60» и 70 мл воды, полученную смесь центрифугируют со скоростью

11000 об/мин для гомогенизации.

Реакционную смесь загружают в Г-образную пробирку и вибрируют с помощью взбалтывателя Моно при 40 С в течение

60 мин. Затем добавляют 30 мл смеси этанола и ацетона в соотношении 1: 1 для разрушения эмульсии. Титруют 0,05 н. раствором

МаОН с применением в качестве индикатора

1%-ного раствора фенолфталеина.

Такое же определение производят с денатурированным ферментом (предварительно ооработанным при 100 С в течение 10 мин).

Затем из первого результата титрования вычитают второй результат и разность, выраженная в расчете на 1 мл, представляет собой титр, который принимают за единицу на 1 мл.

Характеристика продуцентов.

Морфология. Палочка размером 0,6 — 1,2 мк.

Споры не образуют, малоподвижны, грамотрицательные.

Культуральные признаки. В качестве сред используют следующие: маннитнодрожжввчю, среду из дрожжевого экстракта и агара, глюкозопептонную, смесь картофельного экстракта и агара.

Колонии на твердой питательной среде круглые, выпуклые, блестящие и вязкие, светло-желтовато-коричневого цвета. Пигмента не образует.

Физиологическая характеристика.

Оптимальные условия роста: рН среды 6,5, температура 26 С, аэробные.

Биохимические признаки.

Реакция на метил — красный отрицательная.

416958

Составитель В. Дунье

Редактор А. Вер

Корректор В. Брыкснна

Техред Г. Васильева

Г!одпис1 ое

Заказ !553/!5 Изд. ¹ 529 Тираж 456!.11!!!И!1И Государственного комитета Совета Мн;шстров СССР по делам изобретений п открытий

Москва, 0К-35, Раушская паб., л. -!/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Реаиция Важа — Проскауэра отрицательная.

Индола не образует, сероводорода не выделяет, образует аммиак, нитраты восстанавливает, образует каталазу, желатину разжижает, крахмал не гидролизует, молоко не коагулирует, соли аммония и мочевины не уаваивает, метилен голубой не восстанавливает, лакмус восстанавливает, лимонную кислоту усваивает.

Отношение к источникам углерода. Арабинозу, маннозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, сахарозу усваивает. Ксилозу, лактозу, мальтозу, раффинозу, сорбит, иннозит, глицерин, салицин, инулпц, декстрин, целлюлозу не усваивает.

Предмет изобретения

5 .Способ получения липазы путем выращи вания ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углеводов, азота и жиры, например оливковое, рапсовое, соевое масла, в присутствии мппсраnünûх солей с по10 следующим выделением липазы из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют микроорганизмы Chromobacterium viscosum или

Chromobacterium vio1aceum.