Способ определения активности ингибиторов трипсина в плазме крови

 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам определения активности ингибиторов трипсина в плазме крови. Определение активности ингибиторов трипсина проводят в присутствии фермента, субстрата и плазмы, разведенной в 10 и 30 раз, а об истинной активности ингибиторов в неразведенной биологической жидкости судят по формуле X = K(A<SB POS="POST">2</SB>-A<SB POS="POST">1</SB>+A<SB POS="POST">1</SB>C<SB POS="POST">2</SB>-A<SB POS="POST">2</SB>C<SB POS="POST">1</SB>):(C<SB POS="POST">2</SB>-C<SB POS="POST">1</SB>), где X - активность ингибиторов протеолитического фермента

C<SB POS="POST">1</SB> - минимальное разведение

C<SB POS="POST">2</SB> - максимальное разведение

A<SB POS="POST">1</SB> - степень торможения протеолиза при минимальном разведении

A<SB POS="POST">2</SB> - степень торможения протеолиза при максимальном разведении

K - коэффициент пропорциональности.

CQO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51) 5 с 01 И 33/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ пО изОБРетениям и ОтнРытийю

ПРИ ГКНТ СССР

f (21) 4264794/28-14 (22) 1g 02,8/ (46) 23,06.90. Бюл. М 23 (71) Ленинградский педиатрический медицинский институт (72) В.В.Чапенко, P Â.Ситкевич, И.О Чаленко, Г.С.Златин и Т.В.Дмитриева (53) 612.015 (088,8) (56) Лабораторное дело, 1375, Ю1 1, с.9-12. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ИНГИБИТОРОВ ТРИПСИНА В ПЛАЗИЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к способам определения активности ингибиторов трипсина в

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для исследования активности ингибиторов протеолитических ферментов в биологических жидкостях при различных заболеваниях.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Из исследуемой биологической жидкости готовят два разведения в 10 и в

30 раз, в каждом из них определяют антиферментную активность и расчитывают активности ингибиторов, соответствующую неразведенному образцу плазмы.

Пример 1. У практически здоровой женщины 24 лет натощак взята венозная кровь в количестве 9,0 мл в пробирку, содержащую 1,0 мл 3,83ного раствора цитрата натрия. Плазма, „.Я0„„1573430 А 1

2 плазме крови, Определение активности ингибиторов трипсина проводят в при- сутствии фермента, субстрата и плазмы, разведенной в 10 и 30 раз, а об истинной активности ингибиторов в неразведенной биологической жидкости судят по формуле X = K(Az-A,+А,С -A Ñ,):(С2-С,), где X - активйость ингибиторов протеолитического фермента;

С, - минимальное разведение; С максимальное разведение; A - с;епень .торможения протеолиза при минимальном разведении; A - степень торможения протеолиза при максимальном разведении; К - коэффициент пропорциональности. получена путем центрифугирования этой пробирки при 3000 об/мин в течение 10 мин (известные условия, ис-. пользуемые в биохимических исследованиях). Плазму разводили в 10 и в

30 раз 0,05 M трис-НС1 буфером с рН 8,02, содержащим 4 -10 з Н хлорида кальция (буфер, используемый для определения активности трипсина и его ингибиторов в известных способах).

Для этого в две пробирки наливали по 0,1 мл плазмы, по 0,9 мл (для разведения в 10 раз) и 2,9 мл (для разведения в 30 раз) буфера. Из каждой пробирки отбирали по 0,2 мл раствора соответственно разведенной плазмы и вносили в две пробирки, содержащие по 0,2 мл раствора трипсина

74 мкг/мл, приготовленного на том же буфере, и 0,6 мл буфера. Все про1573430

Е(1 - ---) С

Вь в

30 бирки инкубировали 10 мин при 20 С,затем добавляли 1,0 мл раствора казеина по

Гаммарстену, приготовленного на том же буфере, и инкубировали 20 мин при

37 С. В пробирки добавляли 3,0 мл

53-ного раствора трихлоруксусной кислоты, фильтровали через бумажный фильтр "синяя лента" и определяли оптическую плотность против контроля, 10 в который вместо трипсина добавляли

0,2 мл буфера, а трипсин вносили после остановки реакции (после добавления трихлоруксусной кислоты) на спектрофотометре Сф-46 при 280 нм в кювете 1 см.

Отдельно ставили пробу на активность фермента (контроль): в пробирку наливали 0,2 мл раствора трипсина

74 мкг/мл, 0,8 мл буфера и 1,0 мл 20

13-ного раствора казеина. Инкубировали 20 мин при 37 С, добавляли 3,0 мл

53-ной трихлоруксусной кислоты, фильтровали через бумажный фильтр синяя лента" и определяли оптическую плот- 25 ность против дистиллированной воды.

Степень торможения протеолиза при различных .разведениях определяли по формуле: где E - количество фермента в пробе;

В - количество гидролизованного о субстрата в присутствии исследуемого образца (соответствует приросту оптической плотности в условиях опыта);

В - количество гидролизованного 40 субстрата без исследуемого образца (соответствует приросту оптической плотности в пробе на контроль активности фермента);

С вЂ” разведение;

V - объем исследуемого образца (разведенного) в пробе, При разведении s 10 раз A — †6.

При разведении в 30 раз А = 1252.

Истинную активность ингибиторов трипсина в неразведенной плазме расчитывали по формуле

A -A,+A C -AC, х=к С2- С1 где Х - истинная активность ингибиторов протеолитического фермента е неразведенном образ-, це биологической жидкости;

С - минимальное разведение (в

1 l0 раз);

С - максимальное разведение (в

30 раз);

А - степень торможения-,протео1 лиза при минимальном разведении;

А - степень торможения протеолиза при максимальном разведении;

К - коэффициент пропорциональности, зависящий от характеристик используемого фермента и субстрата (в данном случае К 0 1): Х = 1

= 423 мкг трипсина/мл.

Пример 2. Определение проводилось также как и в примере 1, за исключением того, что плазму разводили 10-150 раз.

При разведениях больше 30 наруша— ется линейность зависимости степени торможения протеолиза от разведения.

Это делает невозможным использование больших разведений, так как представленная формула для расчета позволяет определить активность ингибиторов в неразведенной биологической жидкости по результатам степени торможения протеолиза при различных разведениях только при наличии линейной зависимости степени торможения протеолиза от разведения °

Формула изобретения

Способ определения активности ингибиторов трипсина в плазме крови путем проведения протеолиза в присутствии разведенной плазмы с последующим спектрофотометрическим измерением степени торможения протеолиза субстрата, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа плазму разводят минимально в 10 и максимально в 30 раэ, в каждом разведении определяют степень торможения протеолиза субстрата,а активность ингибиторов трипсина в неразведенной плазме определяют по формуле

ХКГА -А, ° Ас:-Ас где Х - активность ингибиторов протеолитического фермента;

1573 30

Составитель Л.Сабурова

Редактор Н.Яцола Техред Л. Серд окова Корректор M.Êóöåðÿâàÿ

Заказ 1642

Тираж 513

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

С1 - минимальное разведение;

С - максимальное разведение;

A - степень торможения протео1 лиза при минимальном разведении;

Д - степень торможения протеолиза при максимальном разведении;

К - коэффициент пропорциональности, зависящий от характеристик используемых фермента и субстрата,