Способ диагностики гемолитической болезни новорожденного

 

Изобретение относится к области медицины, в частности педиатрии. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого проводят определение активности ферментов лимфоцитов и нейтрофилов цитохимическими методами в первые сутки от момента рождения ребенка. И при снижении уровня активности сукцинат-, альфа-, глицерофосфати бета-оксибутиратдегидрогеназ и кислой фосфотазы относительно нормы диагностируют гемолитическую болезнь новорожденного. Способ позволяет с высокой степенью достоверности (100%) осуществлять диагностику заболевания.

„.SU„„1553902

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

А1 (51) 5 Gò 01 N 33 /68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

А0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

APH ГКНТ СССР (21) 4199542/28-14 .(22) 19.01 ° 87 (46) 30,03,90. Бюл, 11 12 (71) Пензенский государственный институт усовершенствования врачей (72) А.И.Зивенко (53) 616,07 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

И 810223, кл. А 61 В 10/00, 19?8. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОЛИТИ;

ЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ НОВОРОЖДЕННОГО (57) Изобретение относится к области медицины, в частности к педиатрии, Изобретение относится к медицине, в частности, .к педиатрии.

Цель изобретения — повышение точности диагностики гемолитической болезни новорожденного, Способ осуществляется следующим образом

Цитохимические методы определения активности ферментов в лейкоцитах предложены P.П, Нарциссовыч.

Выявление сукцинатдегидрогеназы (СДГ) °

Свежезаготовленные и высушенные мазки крови фиксируют при комнатной температуре в течение 30 с, в 60— растворе ацетонтрилоне, приготовленного из 60 мл чистого ацетона и 40 кп дистиллированной воды с добавлением

3-4 г трилона-Б (рН среды 5,2-5,4).

Мазки крови промывают в проточной воде и споласкивают дистиллированной водой, Высушивают при комнатной температуре.

Целью изобретения является, повышение точности способа, Для этого проводят определение активности ферментов лимфоцитов и нейтрофилов цитохимическими методами в первые сутки от момента рождения ребенка. И при снижении уровня активности сукцинат-," альфа-, глицерофосфат- и бета-оксибутиратдегидрогеназ и кислой фосфатазы относительно нормы диагностируют гемолитическую болезнь новорожденного, Способ позволяет с высокой

"степенью достоверности (100X) осуществлять диагностику заболевания.

Высушенные мазки инкубируют в водяной бане при 37 С в течение 1 ч в среде, приготовленной следующим образом, В 300 мл фосфатного буфера (200 мп

1/15 М раствора дигидрофосфата калня и 800 мл 1/15 М гидрофосфата натрия смешивают, исходная рН буфера

7,2-7,4) растворяют 78 мг трилоиа-Б и 78 F пара-нитротетразолия фиолетового. При наличии осадка фильтруют, Базовый раствор: в 40 мл растворяют

540 мг сукцината натрия при 37 С.Про" веряют рН 7,2-7,4, Выявление альфа-глицерофосфатдегидрогеназы (0 ; ГФДГ), В 40 мл базового раствора при

37 С растворяют субстрат — 630 мг о альфа-глицерофосфата, рН среды 7,2 7,4.

Выявление бета-оксибутиратдегидрогеназы (P — ОБДГ), 1553902

К 27 мл ранее приготовленного базового раствора прибавляют 3 мл рабочего раствора р -оксибутирата, .6 мл НАД и 3 мг феназннметасульфата

Рабочий раствор p --оксибутирата готовят следующим образом.

l,5 г оксибутирата растворяют в

30 мл. 1 н. раствора едкого натрия, доводят до рН 7,0 и доливают дистил- 10 лированной водой до 100 мл, После инкубации на водяной бане в термостате мазки в течение 5 мин промывают проточной водой, ополаскивают в дистиллированной воде, Затем прокрашивают ядра клеток в

0,5Х-ном растворе януса зеленого при рН 5,0-5,2 в течение 10 с при комнатной температуре, Вновь промывают в проточной воде, ополаскивают дис- .20 тиллированной водой, Высушивают, а затем микроскопируют под водяной иммерсией.

Активность каждого фермента оценивают по количеству гранул в 50 лим- 25 фоцитах или по среднему количеству гранул в одном лимфоците.

Определение активности кислой фосфатазы лимфоцитов (КФЛ) по методу

Гольдберг и Барка и Р,П. Нарциссову. 30

Свежезаготовленные и высушенные мазки крови фиксируют в холодном о о (+4 С спирт-формалиновом : 9 ч, 96 этилового спирта и I ч. 40 Х-ного раствора формалина} растворе в течение 30 с. Промывают проточной водой и ополаскивают дистиллированной водой, Высушивают при комнатной температуре Зафиксированные и высушенные мазки инкубируют в среде, состоя- 40 щей из растворов А и В. Раствор А:

20 мг нафтола АС-БС фосфата растворяют в 0,5 мл диметилформамида и доливают 40 мл холодного раствора 0,1 н. уксуснокислого натрия. Раствор В: 45

8 капель 4Х-ного раствора азотистокислого натрия соединяют . с 8 каплями 4Х-ного раствора солянокислого фуксина (последний должен просветлеть), Растворы А и В смешивают,тщательно перемешивают и рофильтровывают, Доводят до рН 5,2-5,4, Инкуба»

* ционную .среду подогревают до 37 С на водяной бане, Инкубируют в сухом термостате при 37 С в течение 2 ч, После инкубации мазки ополаскивают

55 в дистиллированной воде и докрашивают 0,5Х-ным раствором металового зеленого на ацетатном буфере в течение 10-15 мин, Вновь промывают в проточной воде, высушивают и микроскопируют под масляной иммерсией, Активность фермента подсчитывают в условных единицах, Определение активности щелочной фосфатазы нейтрофилов (ЩФН) методом азосочетання Гольдберг н Барка, Свежеприготовленные» высушенные н зафиксированные мазки крови (см, определение активности КФН) иикубируют в рабочем растворе, состоящем нз растворов А и В.

Раствор А: 300 мг трисаминометана растворяют в 25 мл дистиллированной воды, 20 мг нафтола. AC-NX фосфа- та растворяют в 0,5 мл диметилформамида, К растворенному нафтолу АС-ИХ» фосфату добавляют раствор трисамииометана.

Раствор В готовят: 10 капель

4 -ного солянокислого фуксина смешивают с 10 каплями 4Х-ного раствора азотнокнслого натрия, Раствор А и В смешивают, доводят до рН 9,5-9,6 и фильтруют, Способ инкубации: на подготовленные мазки наносят рабочий раствор на

30 мин при комнатной температуре.

Затем мазки промывают в проточной воде в течение 5-1.0 мин, ополаскивают в дистиллированной воде. Докрашивают мазки 0,5-1Х-ным раствором йеталового зеленого в течение 5-6 мин, Ополаскивают мазки в проточной воде в течение 1 мин, высушивают. Иикроскопируют под масляной нимерсией,Ак тнвность фермента подсчитывают в усл. ед, Проведя исследования активности ферментов лейкоцитов цитохимическими методами у 60 больных с целью ранней диагностики гемолитической болезни новорожденных, было отмечено,что для развития болезни, также как и ее проявления, характерна фермеиытианая депрессия, При этом по уровню снижения активности ферментов определяют наличие болезни и степень ее тяжести, которые в последствии подтверждались почасовым нарастанием концентрации бнлирубииа или его абсолют ным уровнем, Пример 1. Новорожденная С»» родилась от 2-й доношенной беременности,. срочных родов, У матери во время беременности была нефропатия, протекавшая на фоне гипертонической

55

5 . 1553 болезни, 1-й ребенок жив. Данные роды быстрые, Ребенок Родипся с гипотрофией I, степени. Масса тела 2300 rp.

Оценка по шкале Апгар 8 баллов, Груп5 па крови у матери О (Т) резус-отрицательная, у ребенка — 0 (Х) резусположительная. Титр антиреэусных антител у матери во время беременности 1:2, Масса плапенты 450 гр,Сос- 10 тояние новорожденного тяжелое.Пуповинный остаток прокрашен билирубином, Кожный покров бледно-субиктеричен, Вялый, Мьппечный тонус и рефлексы новорожденного снижены, В легких и сердце без физикальных особенностей, Брадикардия, частота сердечных сокращений 122/мин, Живот мягкий, Печень увеличена, выступает из-под реберной дуги на 3 см, Селезенка пальпируется в пределах 1 см, Клинический анализ крови: Эр

4,4 10 /л, Нв — 166 г/л, Цп 1,0, гематокрит 52Х, лейкоцитов 7,5 х х 10 /л: И 2Х, И 6Х, П 23Х, С 53Х, 25

М 1Х Л 15Х Нормоциты 162 на 100 лейкоцитов. Ретикулоциты 140Х. Биохимический анализ крови: непрямой ° билирубии иэ пуповины 146,8 мкмоль/л, Цитохимические показатели актив- ЗО ности ферментов лейкоциты сравнивали с показателями в норме, полученными в контрольной группе из 72 практически здоровых новорожденных.

Цитохимический анализ крови, г/кл

СДГ 1,7 (норма 12,1+1,1, снижение на 98,6Х); альфа-Г@ДГ 1,1 (норма

7,1+1, О, снижение на 98,5Х); бетаОБДГ 1,4 (норма 14+3,2 снижение на

99Х); КФЛ не определяется (норма

24 1,4), ЩФН - не определяется (иорма в первые сутки 1 28+2,9 усл. ед,), 11итохимические исследования проведенй через 6 ч после рождения, Выставлен клинический диагноз: ге- 45 молитическая болезнь новорожденного, врожденный изоиммуноконфликт по системе резус, желтушно-анемический вариант, тяжелое течение.

Ребенку по жизненным показаниям В0 проведена операция заменного переливания крови, в дальнейшем ему проводилась детоксикациониая инфузионная терапия в сочетании,с фотолечением и симптоматическими препаратами,Затем новорожденный переведен для дальнейшего лечения на второй этап, Таким образом, у новорожденного гемолитическая,болезнь внутриутроб902 6 но имела очень тяжелое течение.Для диагностики болезни затруднений не было ° Данныи пример показывает взаимосвязь между тяжестью болезни и ферментативным уровнем лейкоцитов, При тяжелом течении болезни с выраженными симптомами ферментативная активность лимфоцитов н нейтрофилов практически отсутствует, Следовательно, у новорожденного не было никаких компенсаторных воэможностей инактивировать непрямой билирубин, что потребовало оперативного вмешательства, Пример 2, Новорожденный В,, Родился у матери 36 лет от 6-й беременности, вторых срочных родов, Роды стремительные, в головном предлежании, Дородовое излитие околоплодных вод, I период — 1 ч,15 мин,, II период — 5 мин. Безводный период 5 ч

20 мин. Околоплодные воды светлые, B анамнезе матери 2 медицинских аборта, 2 самопроизвольных выкидыша, 1 роды мертвьи плодом — антенательная гибель плода от резус-конфликта,Масса ребенка 3600 граммов, Оценка по шкале Апгар 8-9 баллов, Группа крови у матери О (Т) резус-отрицательная, у ребенка †. 0 (т) резус-положительная. Титр антирезусных антител у матери во время беременности 1:4.

Объективно: общее состояние новорожденного средней тяжести, Кожный покров чист, подкожная клетчатка выражена хорошо, слегка пастозна,Двигательная активность удовлетворительная. Мьппечный тонус умеренно снижен.

Крупно размашистый тремор конечнос-, тей, Рефлексы новорожденного вызываются частично, Сердечные тоны ритмичны, ЧСС вЂ” 150 уд./мин, Дыхание пуэрильное, ЧД 48/мин, Живот мягкий.

Печень увеличена на 2-2,5 см.Папьпируется край селезенки, Пуповина в повязке, Клинич.анализ крови: Эр

6,5 10 /л; Нв 180 г/л; гематокрит

75; лейкоцитов 21 101/л: П 6Х, С

38Х, М 7Х, Л 45Х; ретикулоцитов 70Х.

Биохимический анализ крови иэ пуповины: непрямой билирубин 44 мкмоль/л, Заключение: период адаптации,угрожаемый по развитию ГБН, Через 4 ч после рождения цитохимический анализ, г/кл: СДГ 9,8; альфа-ГФДГ 1; бета-ОБДГ 1; КФЛ 2,,ИФН не определяется, Через 10 ч после рождения: общее состояние резко ухудшилось за счет

1553902

Симптомов быстронарастающей билирубинемии, интоксикации, Отмечаются

Срыгивания, пастозность тканей лица„ фнижение мышечного тонуса заметное

Ф гнетение рефлексов новорожденного, ивот мягкий, печень +4 см, селезенка +2 см, В клин, анализе крови: Эр.

, 9 10 /л, Нв 166 г/л, г ейатокрит 07; лейкоцитов 12,6 10 /л; ретикулоцитов 57%©. В биохимическом аналие крови уровень непрямого билирубиа 118 мкмоль/л, Почасовой прирост оставил 7,4 мкмоль/л/ч, Диагноз: гемолитическая болезнь оворожденного, послеродовая, иэомуноконфликт по системе резус,желушно-анемический вариант, тяжелое ечение, отечный синдром.

Максимальный уровень непрямого илирубина у больного достиг

48,8 мкмоль/л, Больному произведена операция замененного переливания крови,осуествлялись неоднократные инфузии 25 альбумина, плазмы, детоксикационая терапия, фото- и симтоматическое ечение ° На долечивание переведен ,на второй этап, !

Таким образом, у новорожденного с большим риском развития гемолитической болезни общепринятые методы диагностики не. отражали начавшуюся болезнь, Резкое снижение активности ферментов лейкоцитов и даже их отсутствие указывали на тяжелый гемолитический криз, что потребовало проводить операцию замененного пере ливания крови. Следовательно, состояние уровней активности ферментов лей- 40 коцитов значительно опережает по времени общепринятые методы диагностики, Пример 3. Новорожденная Д., родилась от 7-й доношенной беременности, .вторых срочных родов. Безвод- 4» ный период 3 ч, Передние околоплодные води светлые, задние — примесь мекония. Масса тела 2700 граммов.

Оценка по шкале Апгар 7-8 баллов,.

Группа крови матери А(ХТ) резус-отрицательная, у ребенка A(II) резус50 положительная, Титр антирезусных ан-. тител у матери во время беременности

1:2 °

Обьективно: общее .состояние ребен, ка средней тяжести и обусловлено

55 . симптомами легкой степени асфиксии: мышечный тонус снижен, небольшой амплитуды размашистый тремор верхних конечностей, нижней челюсти, гипорефлексия. В легких и сердце физикально без . патологии. У(ивот мягкий, Печень

+1 см. Селезенка не пальпируется, Уровень Нв 180 г/л, концентрация непрямого билирубина 49,8 мкмоль/л, Через 8 ч после рождения у ребенка на фоне сохраняющейся симптоматики появилась едва заметная субиктеричность кожи лица. Повторно проведены исследования крови: 3p. 5,0 х

10 /л; Нв 180 г/л, Цп 0,9; лейкоцитов 14 10 /л: М 17., 10 27, П 67., С 61%, Л 25%, М 57, гематокрит 48%, Ретикулоциты 65%„, нормоциты 7: 100 лейкоцитов, Концентрация непрямого билирубина 69,7 мкмоль/л„На основании имеющихся отклонений заподозрена гемолитическая болезнь. Почасовой прирост билирубина составил

2,4 мкмоль/л/ч. Цитохимнческий анализ крови, г/кл: СДГ 3,2,", альфа-ГФДГ

2,1; бета-ОБДГ 1,2; КФЛ 4, ЩФН

6 усл,ед, По уровню активности ферментов лейкоцитов диагноз гемолитической болезни не вызывает сомнения, причем вероятность течения средней тяжести, На вторые сутки от момента рождения развилась четкая клиническая симптоматика гемолнтической болезни новорожденного, желтушно-анемический вариант, средне-тяжелое течение, На высоте заболевания гематологические показатели следующие: 3р

3,8.10 /л, Нв 120 г/л, Цп 0,9, лейкоциты 12 ° 10 /л, гематокрит 40%, 9 концентрация непрямого билирубина

201,6 мкмоль/л, После проведенного консервативного лечения ребенок выписан на 12-е сутки в удовлетворительном состоянии 1 под наблюдение участкового педиатра.

Таким образом, на основании клинических и лабораторных данных гемолитическая болезнь была только заподозрена. При этом обычные методы лабораторных исследований в начале заболевания не предсказывали тяжесть течения, тогда как по степени депрессии активности ферментов предсказана тяжесть гемолитической болезни, Пример 4, Новорожденный П,, родился от 1-й беременности, срочных родов, Беременность протекала физиологично, В родах развилась слабость родовых сил: I период — 24 ч, II пе- .

1553902

10

9 риод — 1 ч. Безводный период 9 ч, Околоплодные воды светлые. Родипся мальчик с массой 4200 граммов. Оценка по шкале Апгар 7-8 баллов, Группа крови у матери 0 (I) резус-положительная, у ребенка В (III) резус-положитепьная, При первичном осмотре новорожденного: кожа чистая, розовая, в легких и сердце без особенностей.

Печень и селезенка не увеличены.Рефлекториая деятельность адекватная.

Через 12 ч после рождения состояние несколько ухудшйлось за счет сниже-ния дв»гательной активности и появления легкой субиктеричиости кожных покровов, Печень увеличилась на +l см, селезенка ие увеличена. Дпя исключения геиолитической болезни взяты; аналимы крови Клин»ческий анализ кровщ

Hs 220 г/л3 геиатокрит 65; лейкоцитов 12,8 10 /л 3 ЗХ, П 5Х, С MXs

Л 40Х М 2Х:3»ориобласты .12 иа 100 лейкоцштов. В биохижческои а»ализа крозм кь»це»трация»епряиого бип»ру"би»и 66,4 икиьль/л.

Закаачен»е: »а основан»и клйнических с»и»токов и дополнительных исI следова»ий «рьв»»е выставлен диаг-. ноз геиолитической болев»». Необходааь дмьщешшее»вбавдеине

С щыьш око»чательного решения о вьзиааиош гемьлит»ческой болезни ньвораждеи»ого: проведены цитохииическ»е исследовани», r/кл: СДГ 4,3 . (норма 12,1Ы,1, с»кке»»е иа 65X)3 альфа-РФДГ 3,3 (норма.7, 1f.1,0, сни-. жение»а 54Х);. бета-ОБДГ 1,7. (норма

14+3,2, си»же»»е»а 88X), КФЛ 9 (норма 24+1,4, снижение на 80X); ЩФН 14

Услееде (норма 328 2,9, снижение на

89Х).

Диагноз: геиолитическая болезнь средней тяжести, На вторые сутки появились выраженные симптомы интоксикации и гепербипирубинемии, еще больше снизилась двигательная активность и ответная рефлекторная возбудимость. В клиническои анализе крови! Эр 5,3 10 /л;

Нв 166 г/л; лейкоцитов. 18 10 /л; ге матокрит 45; ретикулоцитов.36Х;.

Содержание непрямого билирубина !

67 мкмоль/л, Диагноз: гемолитическая болезнь новорожденного, послеродовая,изоиммуноконфликт по системе АВО, желтушноанеиическнй вариант, средней тяжести, Новорожденному проведена консервативная терапия, Состояние улучшилось и на 11-е сутки ребенок выписан под наблюдение педиатра.

Таким образом, у данного ребенка гемолитическая болезнь развивалась по групповой несовместимости, Этот вариант болезни имеет более легкое течение по сравнению с резусконфликтом. Вероятно поэтому процент снижения активности ферментов лейкоцитов меньше, чем в примерах 1-3, I

Из примеров 1-4 и цитохимических исследований следует, что ферменты лейкоцитов по разному отражают свое участие в болезненном процессе,Так, щелочная фосфатаэа нейтрофилов (ЩФН), 20 кислая фосфатаэа лимфоцитов (КФЛ), - а также бета-оксибутнратдегидроге: каза указывают на наличие самой гемолнтической болезни, тогда как СДГ

- и альфа-ГФДГ отражают ее тяжесть, 25 Такое дифференцированное участие ферментов в патологическом процессе,seроятно, объясняется глубиной воздействия токсической фракции бнлирубина на функциональные органеллы клеток

З0 крови, находящихся в состоянии имму. нологической реакции, Как видно из клинических примеров, в первую оче.редь страдают сложные эфиры фосфорных соединений, в аспекте которых

З и действуют гидролитические ферменты фосфатаз, Большая тропность непрямого бнлирУбика к жирньвю кислотам липидов и фосфолипидов является подчеркнутой

4О в активности бета-ОБДГ. Именно этот фермент участвует в проиежуточнои превращении жирных кислот, В связи с этим фосфатазы и бетаОБДГ на уровне клетки первмщ реаги48 руют в стадии фориирования и начальном периоде геиолитической болезни.

СДГ и альфа-ГФДà — митохондриальные ферменты лимфоцитов больше указывают на тяжесть гемолитической бо5О лезин, т.е. глубину нли выраженность иимунологического процесса. В связи с этим по степени снижения их активности можно судить о тяжести патологического процесса, Так, снижение бк уровня активности этих ферментов в пределах 70-99Х от нормы следует отнести к тяжелому, на 50-69X — к сред нему течению желтушной формы гемолитической болезни, 15

Составитель Л.Шилина

Техред М.Дндык Корректор О, Кравцова

Редактор Л. Пчолинская

Заказ 453

Подписное

Тираж 505

ВНИИПИ Т осударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,. Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

Обоснованность взятия ферментов в нейтрофилах, в частности ЩФН, для диагностики гемолитической болезни объясняется тем, что эти клетки крови нарождаются, созревают и выходят

s сосудистое русло из миелоидной ткани костного мозга. В организме он является единственным местом,где созревают также и эритроциты, т,е, клетки - мишени к антиэритроцитарным антителам. Таким образом, имеется ! информация о функциональном состоя нии миелоидной ткани. г р

Исследование ферментов лимфоцитов диктуется тем, что гемолитическая болезнь новорожденного формируется с 8-10 недель внутриутробного разви тия плода,, т.е, в те сроки, когда

| закладывается клеточный иммунитет, l и в зависимости от степени иммуноло1 гической сенсибинизации реализуется до или после рождения ребенка. Кроме того, эти клетки имеют полный набор ферментов, обеспечивающие окислительно-восстановительные процессы соответственно их функции, Цитохнмические методы не трудоемки и ие требуют сложного специального оборудования, обладают большой диагностической и прогностической ! информацией, Предложенный способ диагностики

1 и уточнение тяжести гемолитической

53902 болезни дает возможность определить и провести своевременную адекватную терапию, 5

Выявление активности ферментов лейкоцитов в группе новорожденных с большим риском развития.гемолитической болезни (резус-несовместимость матери и новорожденного,токfð сикоз и анемия у беременной, нали чие желтушности у предыдущих детей, мертворождения, повышенный титр антирезусных антител у беремейной и др,) обладает большой диагностичес" кой информацией в случаях развития патологического процесса. Диагноз гемолитической болезни в доклинической стадии подтвержден в 1007 случаев, 20

Формула изобретения

Способ диагностики гемолитической болезни новорожденного путем оп25 ределения белков крови, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа,определяют цитохимически в лейкоцитах ак- тивность сукцинат-, альфа-,: глице3Q рофосфат" и бета-оксибугиратдегидро". геназ, кислой и щелочной фосфатаз в момент рождения и при снижении уровня активности ферментов относительно нормы диагностируют гемолитнческую болезнь новорожденного,