Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus.мusсulus- продуцент моноклональных антител, специфичных к @ - хорионическому гонадотропину человека и @ -лютеинизирующему гормону человека, свиньи и коровы

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), лютеинизирующего гормона человека (ЛГЧ), свиньи (ЛГС) и коровы (ЛГК). Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ), специфичные в β-ХГЧ, β-ЛГЧ, β-ЛГС и β-ЛГК. Штамм получают гибридизацией силеноцитов мышей, линии BALB/с, иммунизированных препаратом ХГЧ с клетками мышиной миеломы Х63.Ад8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N236Д. КЛЕТКИ КУЛЬТИВИРУЮТ В СРЕДЕ RPM 1-1640 с 10%-ной донорской телячьей сывороткой при 37°С в атмосфере 5% CO<SB POS="POST">2</SB>. Клетки пассируют один раз в 3 - 4 дня, кратность рассева 1:2. Секреция монАТ составляет в культуральной среде @ 10 мкг/мл и в асцитической жидкости @ 7 мг/мл. МонАТ относятся к 1GG классу и специфически взаимодействуют с β-ХГЧ, β-ЛГЧ, β-ЛГС, β-ЛГТ. МонАТ могут быть использованы в диагностических целях.

CQO3 СОВЕТСНИХ

СОЩМЛИСТИЧЕСН ИХ

РЕСПУБЛИК

„.Я0„„1555361

А1

ОПИСАНИЕ HSQEPETEKHR

M АВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4446783/30-13 (22) 22.06,88 (46) 07,04.90. Бюл, № 13 (7l) Научно-исследовательский институт морфологии человека АМН СССР (72) P.Ôüùëåð, M,Ш,Вербицкий и И.П.Папазов (53) 578.085.23(088.8) (56) Ozturk M. et а1. Endocrinology

1987, v. 120, № 2, р.549-558. (54) OJTAMM ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS.MUSCULUS — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИ

ФИЧНЫХ К Р-ХОРИОНИЧЕСКОМУ ГОНАДОТРОПИНУ ЧЕЛОВЕКА И / -ЛЮТЕИНИЗИРУЮЩЕМУ

ГОРМОНУ ЧЕЛОВЕКА, СВИНЬИ И КОРОВЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), лютеинизирующего гормона человека (ЛГЧ), свиньи (ЛГС) и коровы (ЛГК). Целью изобреИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано дляопределения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), лютеинизирующего гормона человека (ЛГЧ) лютеинизирующего гормона свиньи (ЛГС) и лютеинизирующего гормона коровы (ЛГК).

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus 1 продуцирующего моноклональные антитела (монАТ ), специфичные к р-ХГЧ, р-ЛГЧ, Р-ЛГС, Р-ЛГК. (51}5 С 12 N 5/00, А 61 К 39/395

2 тения является получение штамма гиб" ридных культивируемых клеток живот-; ных Mus.musculus, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ), специфичные в р-ХГЧ, р-ЛГЧ, а-ЛГС и p-ЛГК, Штамм получают гибридизацией силеноцитов мьппей, линии BALB/с, иммунизированных препаратом ХГЧ с клетками мьппиной миеломы Х63,Ag8.653.

Штамм депонирован под номером

ВСКК(П) ¹ 2360, Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с 10Х-ной донорской телячьей сывороткой при 37 С в атмосфере 5% СО, Клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:2. Секреция монАТ составляет в культуральной среде 10 мкг/мл и в асцитической жидкости, 7 Мг/мл.

МонАТ относятся к IgG классу и специ" фически взаимодействуют с а-ХГЧ, р-ЛГЧ, р-ЛГС, .p --ЛГТ. МонАТ могут быть использованы в диагностических целях, Штамм полуЧают следующим образом.

В качестве антигена использован официальный препарат хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), выпус" каемый Московским Эндокринным заводом.

Мышей линии BALB/с иммунизируют внутрибрюшинно по следующей схеме! в 1-й день — 500 ед. препарата в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) на 14 и 28-й день вводят по 250 ед. препарата с ПАФ, реиммунизируют мы1555361 шей на 56-й день — 2500 ед. препара-, та ХГЧ в забуференном физиологическом растворе хлорида натрия. Через

72-96 ч после ренммуннзации у .мыши стерильно удаляют селезенку и готовят суспензию спленоцитов, Клетки селезенки мьппи BALB/с, иммунизирован;:ной препаратом ХГЧ, сливают с клет-! ками мьппиной миеломы Х63, Ао 8,653, Сливающий агент ПЭГ-1500 (50% раст" . вор), Селекцию проводят на среде НАТ, два клонирования методом лимитирую:щего разведения (1 клетка на 3 лунки) ° )OOX позитивных клонов.

Полученный штамм гибридных клеток обозначен D38. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных

Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) !t 236D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Стандартные условия выращивания - среда RPMI

)640+)0X фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (PCS) температура при культивировании 37 С, га зовая фаза - воздух + 5X СО .

Споооб культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посев,ная доза 500000 клеток/мл, кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня.

Культивирование в организме животного, В организме животного -мышь

ВИ В/с, обработанная пристаиом (0,5 мл в/бр. за 5-40 дней до иноку» лицин) ° доза инокуляции 3-8 млн.кле- . ток, время образования асцита 1020 дней, 40

Продуктивность штамма, Концентрация полезного продукта (монАТ против.Р-ХГЧ, р-ЛГЧ, р-ЛГС, р-ЛГК) в . купьтуральной среде около 10 мкг/мл, s асцитической жидкости - около .7 мг/йл.

Титры данных антител при определении с помощью твердофазного иммуноферментного метода: 1:3000 - в культуральной среде, 2х)0 — в асцитичес- кой жидкости, при концентрации антигеяа при нанесении в лунки пластинки 30 еф/мл официального препарата

ХГЧ Московского эндокринного завода.

Характеристика полученного продук- >>

: Ta. Гибридома секретирует монАТ против ХГЧ ЛГЧ, ЛГС и ЛГК определяе мые иммуноблоттингом, иммуноферментами, иммунофлуоресцентными и радиоиммунными методами. Штамм продуцирует монАТ IgG класса. Продукция монАТ стабильна в течение 30 пассажей ин витро и !5 пассажей на животных, если гибридома перевивается на мьнйах.

Криоконсервнрование. Для длительного хранения клетки штамма в количестве 4х10 в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида замораживают в пенопластиковой коробке при -70 0.

Жизнеспособность клеток после размораживания 70-90Х по окрашиванию трипановым синиле.

Контаминация. Контаминация бактериями и грибами нет, мнкоплаэмы не выявлены.

Пример ), При использовании гибридомы получают специфические к р-ХГЧ, р -ЛГЧ, р-ЛГС и р-ЛГК монАТ

IgG класса путем выделения их из асцитической жидкости мьппи. Иэ 1 мл асцитической жидкости мыши с помощью высаливания сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на колонках с ДЕАЕ-52 целлюло- зой выделяют 8,5 мг монАТ. Контроль на специфичность монАТ проведен в системе твердофазного иммуноферментного анализа.

Полученные монАТ реагируют с р -ХГЧ, ХГЧ, ЛГЧ, ЛГС и ЛГК, не реагируют с ФСГ и ТТГ человека, ФСГ свиньи и коровы и ХГ-лошади.

Пример 2, Продуцируемые штаммом монАТ используют для разработки твердофазной системы конкурентного радиоиммунологического анализа, в которой монАТ фиксировались на полистероловых пробирках. Чувствительность системы 5 мМЕ/мл ХГЧ, коэффициент вариации в серии образцов 3%.

При исследовании мочи больных хорионэпителиомой выявлена корреляция с концентрацией ХГЧ в сыворотке крови и с клиническим, течением заболевания °

Пример 3. Продуцируемые штам" мом монАТ используют для разработки тест-системы нммунофлуоресцентного анализа ХГЧ в моче женщин с целью диагностики раннего срока беременности.

В тест-системе используют твердофазный диагнос тикум, представляющий

Формула изббретения

Штамм гибридных культивируемых кле ток животных Mus,musculus ВСКК(П)

У 236Р - продуцент моноклональных антител, специфичных к р-хорионическому гонадотропину человека и В-лютеинизирунящему гормону человека, свиньи и коровы.

Составитель А,Ианыкин

Редактор Н,Рогулич Техред А.Кравчук Корректор Т.Малец

Заказ 538 Тираж 495 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 1О1

5 15553 собой зерна цианогенбромированной агарозы, на которых конъюгированы монАТ, продуцируемые,штаммом„ Факт связывания ХГЧ с диагностикумом выяв-. ляют с помощью 2-антител - кроличьих моноспецифических антител к ХГЧ, конъюгированных с ФИТЦ. В случае по" ложительной реакции наблюдают яркое краевое свечение зерен диагностикума в люминесцентном микроскопе.

С помощью тест-системы проведено более 150 определенйй,ХГЧ в моче женщин с ранними сроками беременности, показавших хорошую корреляцию

61, 6 с последующей клинической диагности4 кой беременности у обследованных жей . щин. Чувствительность тест-системы

1 МЕ/мл. Точность дИагностики беремейности в сроки 2-4 недели 100Х,