Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus.мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к @ - субъединице гонадотропных гормонов человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для иммунологического определения уровня гонадотропных гормонов в биологических жидкостях организма. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклонольные антитела, специфичные к α-хорионическому, α-лютеинизирующему, α-фолликулостимулирующему и α-тиреотропному гонадотропинам человека. Штамм получен путем гибридизации клеток мышиной миеломной линии Х.63.AG8.653 с клетками селезенки мыши BALB/с, иммунизированной хорионическим гонадотропином человека. Штамм депонирован под номером ВСКК (П) N 235Д. Продуцирует моноклональные антитела JGG класса в количестве 10 мкг/мл культуральной среды и 7 мг/мл асцитической жидкости, титры антител 1:3000 и 2<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">5</SP> соответственно, определенные в твердофазном ИФА.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЙ

Н ASTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

llo изоБРетениям и ОТКРытиям пРи Гннт сссР (21) 4441161 /30-13 (22) 13,06.88 (46) 07.04.90. Бюл, ¹ 13 (71) Научно-исследовательский инсти.тут морфологии человека АМН СССР (72) P.Фидлер (DD), М.DI,Вербицкий и И.П.Папазов (SV) (53) 578.085.23(088.8) (56) Ozturk М. et al. Physiological

studies of human Chorionic Gonadotropin (hCG), ahCG and 8hCG as measured Ъу specific monoclonal Immuno

radiometric Assays. Endocrinology, ч. 120, № 2» 1987, р.549-558. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS.MUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К Ы-СУБЪЕДИНИЦЕ ГОНАДОТРОПНЫХ ГОРМОНОВ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть ис1

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для иммунологического определения уровня гонадотропных гормонов в биологических жидкостях организма, Цель изобретения - получение штам. ма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ), специфичные к с(-хорионическому, -лютеинизирующему, с/-фолликулостимулирующему и o(-тиреотропному гонадотропинам человека.

Штамм получают следующим обра9оМ

„.SUÄÄ1555360 А1 (51)5 С 12 М 5/00 А 61 K 39/395

2 пользовано для иммунологического определения уровня гонадотропных гормонов в биологических жидкостях организма. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклонольные антитела, специфичные к of-хорионическому, (-лютeинизиpующeмy, d-фолликулостимулирующему и o(-тиреотропному гонадотропинам человека. Штамм получен путем гибридизации клеток мышиной миеломной линии Х63.Ag8.653 с клетками селезенки мьппи ВА .В/с, иммунизированной хорионическим гонадотропином человека. Штамм депонирован под номером ВСКК (П) № 235D, Продуцирует моноклональные антитела IgG класса в количестве 10 мкг/мл культуральной среды и 7 мг/мл асцитической жидкости, титры антител 1:3000 и 2х10 соответственно, определенные в твердофазном ИФА.

В качестве антигена использован препарат хорионического гонадотро- © 1 пина человека (ХГЧ) ° Ю

Мьппей линии BALB/ñ иммунизируют внутрибрюшинно го следующей схеме: в

1-й день — 500 ед. препарата в смеси с полным абъювантом Фрейнда (ПАФ) на 14 и 28-й дни — по 250 ед, препарата с ПАФ» реиммунизация на 56-й день - й»

2500 ед, препарата ХГЧ в забуференном физиологическом растворе хлорида натрия. Через 72-96 ч после реиммунизации у мьппи стерильно удаляют се- лезенку и готовят суспензию сплено1555360 цитов. Клетки селезенки мьппи ВА1.В/с иммунизированной препаратом ХГЧ, сливают (гибридизуют) с клетками мыши— ной миеломы Х 63.Ag8,653. Сливающий агент ПЭГ-1500 (50X раствор). Селек5 цию проводят на среде HAT два клонирования методом лимитирующего разведения (l.клетка на 3 лунки), 100Х позитивных клонов.

Полученный штамм гибридных клеток обозначен D85 . Штамм хранится в

Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоноч.ных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК (П) В 2359 и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Стандартные условия выращивания. Среда ДИЕИ+ 20

+102 фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Fcs) температура при о культивировании 37 С, газовая фаза воздух +5X СО, Способ культивирова-! ния — в пластиковых флаконах на 50-." 25

250 мл, посевная доза 500.000 клеток/мл, кратность рассева 1:2 ° время субкультивирования 3-4 дня.

В организме животного — .мьппь ВАЯВ/с обработанная пристаном (0,5 мл в/бр. за 5-40 дней до инокуляции), доза ,инокуляции 3-8 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней.

Характеристика продуцируемого продукта, Штамм гибридных клеток продуцирует монАТ IgG класса, направленные против ° a(-ХГЧ, о(-ЛГ, о(-ФСГ и с(-ТТГ человека. Концентрация полезного продукта (монАТ против Ы-ХГЧ. с1-ЛГ, Я-ФСГ и -ТТГ человека) в культураль- 40 ной среде около 10 мкл/мл,.в асцити- ческой жидкости — около 7 мг/мл, титры данных антител при определении с помощью твердофазного иммуноферментного метода 1:3000 в культуральной 45 среде, 2х10 — в асцитической жидкости, при концентрации антигена при нанесении на пластинки 30 ед/мл официнального препарата ХГЧ.

Определение антител проводят имму50 ,нофлуоресцентными и радиоиммунологическими методами. Продукция монАТ стабильна по крайней. мере в течение

35 пассажей ин витро и 15 пассажей на животных, если гибридома пере.вивается на мьппах. Контаминации бактериями и грибами нет, микоплазмы не выявлены„

Способ криоконсервации. 4х10 клеток B ДИЕИ+10Х Уса+10% DMSO, замораживание в пенопластовой коробке, О г при -70 С, жизнеспособность клеток после разморажив ания 70-90i (оценка жизнеспособности по исключению клетками трипанового синего после 24 ч культивирования), Пример 1. При использовании гибридомы получены специфические к

J-ХГЧ, -ЛГ; Ы-ФСГ и И-ТТГ человека монАТ путем вьщеления их из асци.тической жидкости мьппи. Иэ 1 мл ас-. цитической жидкости с помощью высаливания сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на клонках с ДЕАЕ-52 целлюлозой: выделяют 7,5 мг монАТ к анти- о(-ХГЧ

d-ЛГ, Ы-ФСГ и d-ТТГ человека, Контроль на специфичность монАТ проводят в системе твердофазного иммуноферментного анализа. ИонАТ реагируют с Ы-ХГЧ, цельной молекулой

ХГЧ (официальный препарат ), ЛГ, ФСГ и ТТГ человека, не реагируют с ЛГ свиньи, коровы, лошади, ФСГ-свиньи и коровы и ХГ-лошади.

Пример 2, Продуцируемые штаммом монАТ используют для разработки твердофазной системы иммуноферментного анализа для определения

ХГЧ и ЛГЧ в биологических жидкостях организма, На пластинках адсорбируют монАТ против р-ХГЧ или р-ЛГЧ (10 мкг/мл) инкубируют при 4 С в течение 12-17 ч. Отмывают несвязавшиеся с пластиком монАТ буфером PBS

3 раза; инкубируют пластинки при.ком- . натной температуре в течение 1 ч повторно отмывают 3 раза буфером PBS с твином-20 (0,5 мл на 1 л — 0,05X).

Добавляют исследуемую пробу биологической жидкости (сыворотка крови, моча). Инкубируют 1 ч при 37 С, отмывают 3 раза смесью PBS — твин-20

9 добавляют конъюгированные с пероксидазой монАТ (концентрация 4 мг/мл) в рабочем разведении (1:1600) в PBSтвин-20, Инкубируют 1 ч при 37 С, отмывают 5 раз смесью PBS — твин-20 и 3 раза холодной водопроводной во.— дой, добавляют субстрат, 4 мкл 337 -.

Н О на 20 мин при комнатной температуре. Останавливают реакцию добав лением lOX-.íîãî раствора Н SO и учитывают результат путем измерения оптической плотности при 492 нм, Составитель Г.Смирнова

Редактор Н,Рогулич Техред! А.Кравчук Корректор И,Шароши

Заказ 538 Тираж 495 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Иосква, %-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 155536

Использование штамма гибридомы . позволяет получать монАТ реагирую-, щие с ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ и ТТГЧ в разве-, дении 1 мкг/мл и проводить определения уровня гонадотропиых гормонов в биологических жидкостях организма с помощью иммунологических методов, О 6

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus ВСКК (П) Ф 235D, используемый для получе ния моноклональных антител к а(-субьединице гонадотропных гормонов человека.