Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной и растворимой формам н антигена человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной и растворимой форм Н-антигена человека. Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, используемого для получения моноклональных антител (монАТ), пригодных для выявления мембраносвязанной и растворимой форм Н антигена человека в реакции ингибирования агглютинации. Штамм получен в результате слияния мышиной миеломы РЗ-Х63-Ад8. 653 с клетками селезенки мышей линии BALB/C,иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 254Д. Клетки культивируют в среде RPMI 1640 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Частота пассивирования 2-3 сут, кратность рассева 1:3-1:4. Стабильная продукция монАТ в асцитной жидкости - 1:256.10<SP POS="POST">3</SP>-1:512.10<SP POS="POST">3</SP>, в культуральной - 1:256-1:512. МонАТ относятся к классу 1дМ, они специфичны для Н-антигена на мембранах эритроцитов и в слюне лиц-выделителей групповых веществ. МонАТ могут быть использованы в диагностических целях.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19! (11! (1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4452025/30-13 (22) 29.06,88 (46) 23.03,90. Бюл. 1(11 (71) Всесоюзный гематологический научный центр (72) Е.И.Дерюгина, Н.И.Дризе, Л,Н,Леменева, F..Í .Ñàäîâíèêîâà, Г.А.Удалов, И.Л.Чертков, М.И.Лапенков и A.Å.Íîñûðåâ (53) 578.085.23(088.8) (56) Наставление по применению гете4 ропммунной анти-Н козьей сыворотки диагностической жидкости для судебно-медицинских целей. МЗ СССР. Утв.

20.06.74, Патент ГДР М 241852, кл. А 61 К 39/395, С 12 N 5/02, 1987. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS. MUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К МЕМБРАНОСВЯЗАННОЙ И

РАСТВОРИМОЙ ФОРМАМ Н-АНТИГЕНА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной и растворимой форм Н-антигена человеИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной и растворимой форм Н-антигена человека.

Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus используемого для получения моноклональных антител (MOHAT), при- (51) 5 С 12 N 5/00, А 61 К 39/395

2 ка. Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus используемого для получения моноклональных антител (МОНАТ), пригодных для выявления мембраносвяэанной и растворимой форм Н-антигена человека в реакции ингибирования агглютинации. Штамм получен в результате слияния мышиной миеломы РЗ-Х63Ag8.653 с клетками селезенки мышей линии BALB/с, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) !

1 254D ° Клетки культивируют в среде

RPMI 1640 с 207 эмбриональной телячьей сыворотки. Частота пассивирования 2-3 сут кратность рассева 1:31:4. Стабильная продукция МОНАТ в асцитной жидкости — 1:256 10 — 1:5!2« э

«!О, в культуральной 1:256-1:512. э

МОНАТ относятся к классу 1 gM они специфичны для Н-антигена на мембранах эритроцитов и в слюне лиц-выделителей групповых веществ. МОНАТ могут быть использованы в диагностических целях. 2 табл. годных для выявления мембраносвязанной и растворимой форм Н-антигена человека в реакции ингибирования агглютинации.

Штамм перевиваемых гибридных клеток мьппи Mus. musculus Н-86/44 получен в результате слияния мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag8.653 с клетками селезенки мышей линии BALB/с, иммунизированных эритроцитами человека фено1551737 типа PN. При слиянии использовали полиэтиленгликоль мол.мас, 3000, соотношение миеломных клеток и спленоцитов было 1:3 при общем количестве спленоцитов и клеток миеломы 450" 10 и 160 1О соответственно. Селект 6 цию неслившихся клеток проводили в среде, содержащей аминоптерин (IIATсреда).

РIтамм получен в результате 4-кратного клонирования методом лимитирующего разведения при 98-100 антителопродуцирующих клонов во всех клонированиях. 15

Штамм Н-86/44 хранится в коллекции перевиваемых клеточных линий позвоночных по K" ВСКК(П) 254D и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Культу- 20 ра состоит из слабо прикрепленных к субстрату клеток с обычной для гибридных антителопродуцирующих клеток морфологией.

Кариологические признаки. Карио- 25 тип соответствует Моя. musculus. Модальное число хромосом 78 с интервалом варьирования 74-80. С помощью Сокрашивания выявляются две большие метацентрические хромосомы. 30

Культуральные признаки. Среда для культивирования RPMI 1640 или ДМЕМ с 20 . эмбриональной телячьей сыворотки, 4 MY. Ь-глютамина, l пирувата натрия, 1-2 HEPES-буфера, 5 10 M

2-меркаптоэтанола, антибиотики. Õàрактер роста — стационарная суспензия. Метод снятия — резиновым "поли— сменом". Частота пассирования 2-3 сут.

Кратность рассева 1:3-1:4.

При введении мышам BALB/с предварительно обработанных пристаном 2-5 " 10 клеток асцит образуется через

20 сут. Стабильная продукция антител наблюдается в течение 2 пассажей на 45 мышах, титр антител в асцитной жидкости составляет 1:256-1:512 тыс., в культуральной 1:256-1:512.

Характеристика моноклональных антител МОНАТ, продуцируемые штаммом Н-86/44, выявляют Н-антиген на мембранах эритроцитов и в слюне лицвьщелителей групповых веществ (1 gM).

Консервация клеток. Криозащитная среда: 50 . среды, 40 . сыворотки, Ip диметилсульфоксида.

Режим замораживания. Клетки в криозащитной среде помещают на суто ки при -70 С, после чего переносят в жидкий азот. Выживаемость клеток при размораживании составляет 70-85 . от жизнеспособных клеток до замораживания.

Сведения о контаминации линии.

Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы

»е обнаружены. Вирусы не тестированы.

Пример. Активность МОНАТ

II-86/44 в серологических реакциях.

Образцы индуцированной клетками штамма культуральной и асцитной жидкости исследовали по известным методам.

Таблица I

Разве- Титр Авидность, дение с

Антитела

Гетероиммунная анти-Н антисыворотка, с.20

MOHAT Н-86/

/44 культуральная жидкость

МОНАТ Н-86/

/44 асцитная жидкость 1:100

1:2 7-13-18

1:8 3-8-11

1:64 0-1-2

Результаты исследования активности (титра и авидности) МОНАТ Н-86/44 в реакциях прямой агглютинации эритроцитов.

Титр и авидность антител определяют в реакции агглютинации на плоскости и в солевой среде в 96-луночных микроплатах. Под титром антител в реакции на плоскости подразумевают такое их последнее разведение, при котором агглютинаты начинали образовываться не позднее 30 с, а в реакции агглютинации в солевой среде— такое последнее разведение, при котором в ячейке наблюдали агрегаты эритроцитов. Под авидностью антител подразуевают сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам человека, оцениваемое в реакции агглютинации на плоскости по времени появления первых агглютинатов (первый параметр), времени наступления четкой реакции агглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр).

Результаты, приведенные в табл.l и 2, показывают, что MOHAT H-86/44 как в культуральной жидкости, так и

5 в реагенте, приготовленном путем разведения асцитной жидкости в 100 раз

0,3 М раствором хлористого натрия, по отношению к эритроцитам фенотипа

0 обладают гораздо более высокими титрами и лучшей авидностью по сравнению с гетероиммунными козьими анти-Н сыворотками.

1551737

Та блица 2

Титр по отношению к

Антитела

Серия, Яо эритроцитам фенотипа 0

Гетероиммунная анти-Н ан1:2-1:3

1:2-1:4

1:4-1:8

108

79 тисыворотка

M0HAT H-86/44 культуральная жидкость

Формула изобретения

1-256-1:512

1:!28

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus ВСКК(П)

20 - 254D, используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной и растворимой формам Н-антигена человека, MOHAT H-86/44 асцитная жидкость, разведение 1:100

1:2048

1:256

Составитель А.Маныкин

Редактор Н,Рогулич Техред M.Äèäûê

Корректор Н.Король

Заказ 309 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101