Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus.мusсulus для получения моноклональных антител к группоспецифическому антигену м системы mnss эритроцитов человека

 

Изобретение относится к медицине, в частности к судебной медицине и иммунологии, и может быть использовано для выявления группоспецифического антигена М в эритроцитах человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего высокоактивные и специфичные моноклональные антитела, выявляющие антиген М системы MNSS эритроцитов человека. Штамм получают путем слияния по методу Келера и Мильштейна клеток мышиной миеломы с клетками селезенки мышей, предварительно иммунизированных эритроцитами человека группы А (П) ММ. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под N 860. Моноклоальные антитела, секретируемые клетками штамма М-86/1 N 86Д при культивировании их в брюшной полости мыши, позволяют путем разведения асцитной жидкости в 100 раз иметь высокоактивный, стандартный, специфичный реагент анти-М для выявления антигена М в эритроцитах человека. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИ Х

РЕСПУБЛИН

А1 (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ б1 п

itatili1

М .А

ГОСУДАРСТ9ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4280331/28-13 (22) 07.07 ° 87 (46) 15.12.89. Бюл. Н 46 (71) Центральный научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (72) Е.А.Дерюгина, Н.И.Дризе, Л.Н.Леменева, Е.Ю.Садовникова, Г.Н.Удалов, И.Л.Чертков и И.М.Гуртовой (53) 612.118.221.2(088.8) (56) Nichols M.Е., Rosenfield R.Е., Pablo Р, Two blood group M epitops

disclosed by monoc)onal antibodies.

Чох Sang. 1985, N 49, 2, р. 138-148. (S4) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MVS. MUSCULUS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГРУППОСПЕЦИфИЧЕСКОМУ АНТИГЕНУ М СИСТЕМЫ

MNSs ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к медицине, в частности к судебной медицине и иммунологии, и может быть использовано

Изобретение относится кмедицине и касается штамма мышиных гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела, пригодные для выявления группоспецифического антигена М в эритроцитах человека.

Целью изобретения является получение высокоактивных и специфичных моноклональных антител, выявляющих антиген М системы МЫВШИ эритроцитов человека ° (51) 4 С 12 N 5/00, С 12 P 21/00, А 61 К 39/395

2 для выявления группоспецифического антигена M в эритроцитах человека.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего высокоактивные и специфичные моноклональные антитела, выявляющие антиген М системы MNSs эритроцитов человека. Штамм получают путем слияния по методу Келера и Мильштейна клеток мышиной миеломы с клетками селезенки мышей, предварительно иммунизированных эритроцитами человека группы a(il) ММ. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных института цитологии

АН CCCP под 1(860. Моноклональные антитела, секретируемые клетками штамма M-86/1 !(86Д при культивировании их в брюшной полости мыши, позволяют путем разведения асцитной жидкости в 100 раз иметь высокоактивный, стандартный, специфичный реагент ан" ти-М для выявления антигена M в эритроцитах человека. 1 табл.

Пример 1. Штамм перевиваемых гибридных клеток мыши Mus musculus

М-86/1 получают в результате слияния мышиной миеломы РЗ-Х63-Ag.8.653 с клетками селезенки мышей, линии

Ba1b/с, иммунизированных эритроцитами человека группы A(II) ММ под воздействием полиэтиленгликоля М.В. 1,5 тыс. и в дальнейшем культивируют в селективной среде ГАТ. При слиянии используют соотношение миеломных клеток

1528791 к лимфоцитам - 1:2 при общем количестве спленоцитов 370 10 и клеток

6 миеломы 185 10 . Эффективность гибридизации 90 ь.

Штамм получен в результате 3-кратного клонирования методом лимитирующего разведения при 1003 антителопро! дуцирующих клонов в 2-х последних клонированиях. 10

Штамм М-86/1 хранится s коллекции перевиваемых кпеточных линий позвоночных под У 86-Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные характеристики. Ста- 15 ционарная суспензионная культура клеток в жидкой среде, содержащая 3004O0xl0 кл/мл. Рассаживание 1:?-1:3 через 2-3 сут при снятии клеток рези новым "полисменом". Клонирование осу- 20 ществляется на перитонеальных макрофагах мыши.

Среда для культивирования - RPNI1640 или ДМЕМ с 204 эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ l-глутамина, 25

1ь пирувата натрия, 1-2ь гепес-буфера„

5х10 2-меркаптоэтанола, 50 ед./мл пенициллина, 25 мкг/мл стрептомицина, 37 С, 951 влажности, бь СО в воздухе.

Культивирование гибридных клеток 30 в организме животногс: мыши линии

Balb/с, пристан по 0,5 мл внутрибрюшинно за 7-30 сут до ввсдения клеток по 3-6х10 кл/мышь. Среднее врем; рос та гибридомы в arцитной форме 12 су .

Морфология клеток: штамм представ35 лен слабо прикрепляющимися к субстрату клетками с обычной для антителообразующих клеток морфологией.

Видовая принадлежность штамма доказана цитогенетическим методом.

Кариотип соответствует виду Nus

musculus. Модальное число хромосом

89, генетические маркеры — 2 метацентрические хромосомы ° 45

Сведения о комтаминации линии: не обнаружена контаминация бактериями, грибами и микоплазмой. Вирусы не тестированы.

Характеристика полезного вещества, продуциируемого штаммом: 1 gM анти-М антитела, агглютинирующие эритроциты человека, содержащие М антиген. Метод тестирования - ;,ããëþòèíàöèÿ в солевой среде или на плоскости.

Характеристика биосинтеза полезных

55 продуктов: титр антител культуральной жидкости в реакции солевой агглютинации в круглодонных микроплатах 1:256, титр антител асцитной жидкости

1:256 - 1:512xl0s.

Стабильность антителопродукции сохраняется в течение 11 пассажей в культуре и 2 пассажей в мыши.

Криоконсервирование клеток: ростовая среда, 104 ДМСО, 404 эмбриональной телячьей сыворотки, режим 1 C/ìèí до -40 С, 10 С/мин до -120 С, далее жидкий азот. Жизнеспособность после размораживания по трипановому синему

70-72 3. После размораживания культивирование ведут в 24 ячеечных платах ь по 0,5xlO жизнеспособных клеток/ячей.ку на фидере из перитонеальных макрофазов мыши (2х10 клеток/ячейку).

Образцы индуцированной клетками штамма M-86/ 1 асцитной жидкости мышей исследуют по общепринятым методам со стандартными эритроцитами в солевой среде в 96-луночных платах (титр антител) и я реакции агглютинации на плоскости (авидность антител). Под авидностью антител подразумевается сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам человека, оцениваемое по времени появления первых агглютинатов (первый параметр), времени наступления четкой реак: ии агглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр).

Результаты исследования активности (титра) и авидности моноклональных антител, секретируемых клетками штамма М-86/1 и направленных к антигену М системы ММ$Б эритроцитов человека, представлены в таблице.

Результаты, приведенные в таблице, показывают, что моноклональные анти-тела асцитной жидкости штамма M-86/ 1, специфически реагируют с антигеном М в эритроцитах ММ и MN. При этом титр моноклональных антител, секретируемых штаммом М-86/1, в 8000 и 16000 раз выше титра антител гетероиммунной кроличьей сыворотки при определении титра в солевой среде и в 1600 и 3200 раз при определении титра на плоскости по отношению к эритроцитам MN и ММ соответственно. Авидность моноклональных антитеп асцитной жидкости, разведенной в 100 раз, также значительно выше авидности антител гетероиммунной кроличьей сыворотки.

Таким образом, моноклональные антитела, секретируемые штаммом M-86/1 в асцитной форме, позволяют путем раз1 6 троцитами и дает более стандартные результаты.

5 152879 ведения асцитной жидкости в 100 раз иметь высокоактивный стандартный высокоспецифичный реагент анти-М для выявления антигена М в эритроцитах

5 человека, Кроме того, получение моноклональных анти-M антител с помощью штамма перевиваемых гибридных клеток штамма М-86/1 в брюшной полости мыши менее трудоемко, чем получение гетероиммунной кроличьей сыворотки, не требует дополнительной абсорбции эриФормула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus BCKK(II)

86-Д для получения моноклональных антител к группоспецифическому антигену M системы MNSs эритроцитов человека.

Авидность (в сек) с эритроцитами

Титр в реакции агглютинации на плоскости эритроцитами

Разведение

Титр в реакции солевой агглютинаАнтитела ции с эритроцитами

ММ

Гетероиммунная кроличья сыворотка (сер.

6-8-10 9-12-15

1:4

98) 1: 16 1: 16

1:4

Моноклональные антитела штамма

Н-86/1 (асцитная жидкость) 1:256х х10з

1: 128х10 1: 100 1: 12800 1: 6400

1-2 3

1-2. 3

П р и м е ч а н и е. С эритроцитами MN, т.е. не содержащими антигена М, ни гетероиммунная кроличья сыворотка, ни моноклональные анти-М антитела агглютинации не дают.

Составитель С.Светлышев

Техред Л,Сердюкова Корректор M.Âàñèëüåâà

Редактор М.Недолуженко

Заказ 7616/23 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,101