Способ получения комплекса литических ферментов

 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской отраслям промышленности, а именно к получению ферментного комплекса, лизирующего грамположительные микроорганизмы, в частности патогенные множественно устойчивые к антибиотикам стафилококки, гемолитические стрептококки группы А, радиоустойчивые микрококки и лонингококки. Цель изобретения заключается в увеличении содержания комплекса литическиих ферментов в культуральной жидкости и сокращении длительности процесса. Способ получения комплекса литических ферментов заключается в том, что отселекционированный штамм продуцент Xanthomonas sampestris ВКПМ В - 4102 1 9 пассажа культивируют на питательной среде, содержащей глюкозу, бактопептон, белково витаминный коцентрат, фосфорнокислые соли калия и натрия, сернокислый магний, хлористый натрий, сернокислое железо и воду при следующем содержании компонентов, г/л: глюкоза 2,00 12,00; бактопептон 2,00 6,00; белково витаминный концентрат 2,50 6,00; Na₂HPO₄ 12H₂O 0,50-4,00; KH₂PO₄ 0,10-1,00; MgSO₄7H₂O 0,20-3,00; NaCl 0,35 1,00; FeSO₄7H₂O 0,01-0,25; вода до 1 л, при этом культивирование осуществляют при 29 31°С, pH 6,2 7,5 и парциальном давлении кислорода 30 85% от насыщения. Процесс прекращают после достижения стабильной литической активности культуральной жидкости.

Изобретение относится к микробиологической и медицинской отраслям промышленности и представляет собой способ получения ферментного комплекса, лизирующего грамположительные микроорганизмы, в частности патогенные множественно устойчивые к антибиотикам стафилококки, гемолитические стрептококки группы А, радиусоустойчивые микрококки и менингококки. Комплекс литических ферментов может найти применение при лечении ряда заболеваний, вызываемых патогенными грамположительными микроорганизмами, при лечении ран, ожогов и других повреждений кожи. Целью изобретения является увеличение содержания комплекса литических ферментов в культуральной жидкости и сокращение длительности процесса. Способ получения комплекса литических ферментов заключается в том, что отселекционированный штамм продуцент Xanthomonas campestris ВКПМ В-4102 1-9 пассажа культивируют на питательной среде, содержащей глюкозу, бактопептон, белково-витаминный концентрат (БВК), фосфорнокислые соли калия и натрия, сернокислый магний, хлористый натрий, сернокислое железо и воду при следующем содержании компонентов, г/л: глюкоза 2,00-12,00; бактопептон 2,00-6,00; БВК 2,5-6,00; Na₂HPO₄ x 12H₂O 0,5-4,00; КН₂РО₄ 0,10-1,00; MgSO₄ 7 H₂O 0,2-3,00; NaCl 0,35 1,00; FeSO₄ 7H₂O 0,01-0,25; вода до 1 л, при этом культивирование осуществляют при 29-31^оС, рН 6,2-7,5 и парциальном давлении кислорода 30-85% от насыщения. Процесс прекращают по достижении стабильной литической активности культуральной жидкости. Биомассу отделяют центрифугированием, комплекс литических ферментов, содержащихся в растворе, выделяют, используя дробное осаждение ацетоном с последующим фракционным осаждением сульфатом аммония, осадок растворяют, раствор диализуют, лиофильно сушат. Периодический отбор активных форм штамма-продуцента и использование продуцента только 1-9 пассажа позволяют получать стабильный уровень содержания литического комплекса в культуральной жидкости в ферментационных процессах. Среда, используемая в предлагаемом способе, содержит основные питательные вещества, факторы роста и минеральные компоненты, необходимые для роста культуры и образования продукта. Использование в качестве источника углерода глюкозы, БВК и повышенных концентраций сернокислого магния интенсифицирует синтез ферментов комплекса, ответственных за лизис клеточных стенок. Установленные соотношения компонентов среды и режимы культивирования (см. табл. 1, 2 и 3) позволяют повысить содержание комплекса литических ферментов в среде в 1,2-2,2 раза и сократить длительность процесса получения продукта в 2,5-3,0 раза за счет уменьшения времени выделения продукта. Литическая активность культуральной жидкости при различных температурах культивирования: Темпера- тура, ^оС 20 25 28 30 31 32 34 Активность, ед./мл 0 10 24 31 33 22 10 Причем культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102 выращивают на установке АНКУМ-2 в непрерывных условиях при температуре 20-34^оС и скорости протока 0,1-1 ч. Литическую активность определяют после установления подвижно-равновесного состояния системы. Биосинтез литического комплекса в интервалах рН 5,0-8,5: рН 5,0 5,5 6,0 7,0 7,5 8,0 8,5 Актив- ность, ед./мл 0 7 23 46 38 27 17
При этом культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102 выращивают на установке АНКУМ-2 в периодических условиях при 301^оС. Биосинтез литических ферментов при различных величинах парциального давления кислорода в культуральной жидкости:
Парциальное
давление
кислорода
в культу-
ральной
жидкости,
от насыщения 85 60 40 30 22 12
Литическая
активность
культураль-
ной жидкости,
ед./мл 42 37 44 40 22 18
При этом культуру Xanth. campestris В-4102 выращивают при 301^оС, рН 7,0-7,6. Литическую активность в процессе культивирования и в ходе выделения ферментного комплекса определяют следующим образом. К 2 мл суспензии лиофилизированных клеток Micrococcus lysodeikticus в 0,01 М трис-буфере, рН 8,4-8,5 с концентрацией 0,5-0,6 ед. оптической плотности (ФЭК-56М, _кюв. 3 мм, с/ф N 6), прогретой в течение 10 мин при 37^оС, добавляют 0,1 мл пробы, смесь инкубируют 5 мин при 37^оС. Активность рассчитывают по формуле
E (ед./мл) где D_o оптическая плотность контроля;
D оптическая плотность пробы после
инкубации;
t время инкубации, мин;
Р разведение пробы;
0,01 оптическая плотность, соответ-
ствующая 1 ед. активности;
0,1 объем пробы, мл. Активность комплекса может быть определена также с использованием в качестве субстрата живых клеток Staphylococcus aureus. П р и м е р 1. В посевной аппарат вносят 20 л питательной среды, состава, г/л: Глюкоза 10,00 Бактопептон 5,00 БВК 3,00 Na₂HPO₄ 12H₂O 1,50 KH₂PO₄ 0,35 MgSO₄ 7H₂O 0,35 NaCl 0,35 FeSO₄ 7H₂O 0,05
Доводят рН до 7,0 с помощью 10%-ного раствора NaOH и стерилизуют среду паром. В стерильную среду вносят 3% инокулюма Xanth. campestris ВКПМ В-4102 из колб и выращивают посевной материал в течение 19 ч при 31^оС, 300 об/мин мешалки, подача воздуха 0,5 об. в 1 мин на 1 об. среды. Не допускают снижения рН среды ниже значения 6,2. В 250-литровый ферментер вносят 130 л питательной среды указанного выше состава, доводят рН до 7,0 и стерилизуют в течение 60 мин при давлении 1,0 кгс/см². Раствор фосфатов стерилизуют отдельно при том же режиме. Глюкозу стерилизуют отдельно при 0,5 кгс/см² 30 мин. Из посевного аппарата в ферментер передают 20 л посевного материала и ведут культивирование при 31^оС, подаче воздуха 0,5 об. в 1 мин на 1 об. среды, чтобы парциальное давление кислорода в среде не опускалось ниже 30% от насыщения. Уровень парциального давления кислорода регулируют, в основном, изменением режимов перемешивания во избежание усиленного пенообразования, возникающего при регуляции р О₂ за счет расхода воздуха. В случае необходимости можно изменять и расход воздуха. Не допускают снижения рН среды ниже 6,2 и увеличения выше 7,5, подавая в среду соответственно 10%-ный раствор NaOH или 10% -ный раствор HСl. К 23 часу кульвитирования активность литического комплекса составляет 44 ед./мл. Для выделения литического комплекса ферментов культуральную жидкость (145 л) охлаждают до 6^оС, отделяют из биомассы культуры на сепараторе ОСБ (Плавский з-д "Смычка") при 11000 об/мин. Из фильтрата производят фракционное осаждение белков охлажденным до 5^оС ацетоном. Сначала загружают ацетон из расчета 1 об. на 1 об. фильтрата, выдерживают при отключенной мешалке 1 ч и осадок отделяют на сепараторе. К осветленному фугату добавляют ацетон из расчета 1,5 об. на 1 об. исходного фильтрата культуральной жидкости и выдерживают в течение 1 ч. Осадок отделяют на сепараторе. К осветленному раствору добавляют сульфат аммония до 80% насыщения, выдерживают 5 ч и отделяют осадок сепарированием. Осадок (450 г) растворяют в 3,2 л дистиллированной воды при 5^оС до электропроводности диализуемого раствора 6,0. Отдиализованный раствор ферментов замораживают и лиофильно сушат. Получают 71,16 г готового препарата литического комплекса ферментов с активностью 18,3 ед. /мг препарата. Выход готового препарата от содержания литического комплекса в культуральной жидкости составляет 20,6%
П р и м е р 2. В колбу емкостью 750 мл вносят 100 мл питательной среды состава, г/л: Глюкоза 11,80 Бактопептон 5,80 БВК 6,00 Na₂HPO₄ 12H₂O 1,80 KH₂PO₄ 0,50 MgSO₄ 7H₂O 1,00 NaCl 0,50 FeSO₄ 7H₂O 1,00
Доводят рН среды до 7,0 10%-ным раствором NaOH. Колбу со средой стерилизуют. В стерильную колбу со средой вносят 5% инокулята Xanth. campestris ВКПМ В-4102 и культивируют в течение 20 ч при 301^оС на качалке (200 об/мин). Бактериальные клетки отделяют центрифугированием. К 19 часам культивирования активность литического комплекса составляет 35 ед./мл. П р и м е р 3. Культивируют Xanth. campestris ВКПМ В-4102, как указано в примере 2, на среде следующего состава, г/л: Глюкоза 5,00 Бактопептон 5,00 БВК 2,50 Na₂HPO₄ 12H₂O 4,00 KH₂PO₄ 0,50 MgSO₄ 7H₂O 1,25 NaCl 1,00 FeSO₄ 7H₂O 0,20
К 34 часам культивирования литическая активность культуральной жидкости составляет 63 ед./мл. П р и м е р 4. Культивируют Xanth. campestris ВКПМ В-4102, как указано в примере 2 на среде состава, г/л: Глюкоза 2,0 Бактопептон 2,0 БВК 5,0 Na₂HPO₄ 12H₂O 2,0 KH₂PO₄ 1,0 MgSO₄ 7H₂O 3,0 NaCl 2,0 FeSO₄ 7H₂O 0,06
К 34 часам культивирования литическая активность культуральной жидкости 53 ед./мл. П р и м е р 5. Культивируют Xanth. campestris ВКПМ В-4102, как указано в примере 2 на среде состава, г/л: Глюкоза 2,0 Бактопептон 2,0 БВК 2,5 Na₂HPO₄ 12H₂O 0,5 KH₂PO₄ 1,0 MgSO₄ 7H₂O 0,2 NaCl 1,0 FeSO₄ 7H₂O 0,01
К 34 часам культивирования литическая активность культуральной жидкости составляет 38 ед./мл. П р и м е р 6. Культивируют культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102, выращивают на установке АНКУМ-2 в периодических условиях на среде, указанной в примере 1, при 30^оС и рН 7,0
К 23 часам культивирования литическая активность культуральной жидкости составляет 46 ед./мл. П р и м е р 7. Культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102 выращивают, как описано в примере 6, при рН 7,5. К 23 часам культивирования литическая активность составляет 38 ед./мл. П р и м е р 8. Культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102 выращивают в ферментере емкостью 10 л в периодических условиях при 31^оС, рН 7,3 и парциальном давлении кислорода 85% от насыщения. К 24 часам культивирования литическая активность составляет 42 ед./мл. П р и м е р 9. Культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102 выращивают, как описано в примере 8, при парциальном давлении 30% от насыщения. К 25 часам культивирования литическая активность составляет 40 ед./мл. П р и м е р 10. Способ получения стерильного литического препарата. Получают литический препарат, как описано в примере 1. Препарат расфасовывают в стеклянные флаконы, герметично закрывают. Стерилизацию проводят -облучением (СО⁶⁰) по методу Тацуси Кавахата и др. (акцептованная заявка Японии N 49-39837 "Метод производства стерильных препаратов ферментов"), используя дозу от 0,4 до 1,5 Мрад. Стерильность готового препарата 100% (стерильность определяют микробиологически высевом на тиогликолевую среду, сусло, среду Сабуро). Литическая активность препарата после стерилизации сохраняется. Препарат сохраняет стерильность и активность в течение 3 лет при хранении при 10^оС. Использование предлагаемого способа получения литических ферментов позволяет увеличить содержание комплекса литических ферментов в культуральной жидкости с 28 (в прототипе) до 35-63 ед./мл, т.е. в 1,2-2,2 раза, и сократить длительность процесса получения продукта в 2,5-3 раза за счет уменьшения времени выделения литического комплекса в 25-30 раз на стадии концентрирования. Предлагаемый способ выделения продукта снимает необходимость применения импортных оборудования и материалов при получения комплекса литических ферментов в промышленных условиях. Кроме того, использование сырья, выпускаемого отечественной промышленностью, дает возможность снизить стоимость сырья на стадии ферментации.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем культивирования штамма продуцента Hanthomonas campestris ВКПМ В-4102 на питательной среде, выделения целевого продукта из культуральной жидкости и его сушки, отличающийся тем, что, с целью увеличения содержания комплекса литических ферментов в культуральной жидкости и сокращения длительности процесса, для культивирования используют отселекционированный штамм продуцент 1 9 пассажа и питательную среду, содержащую глюкозу, бактопептон, белково-витаминный комплекс, фосфорнокислые соли калия и натрия, сернокислый магний, хлористый натрий, сернокислое железо и воду при следующем соотношении компонентов, г/л:
Глюкоза 2,00 12,00
Бактопептон 2,00 6,00
Белково-витаминный комплекс 2,50 6,00
Na₂HPO₄ 12 H₂O 0,50 4,00
KH₂PO₄ 0,10 1,00
MgSO₄ 7 H₂O 0,20 3,00
NaCl 0,35 1,00
FeSO₄ 7 H₂O 0,01 0,25
Вода До 1 л
при этом культивирование осуществляют при 29 31^oС, рН 6,2 7,5 и парциальном давлении кислорода 30 85% от насыщения. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при выделении целевого продукта перед фракционным осаждением сульфатом аммония проводят дробное осаждение ацетоном.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 05.10.2003

Извещение опубликовано: 10.10.2004        БИ: 28/2004

---