Способ выделения 5 @ -нуклеотидазы из яда кобры
Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению чистой 5 @ -нуклеотидазы яда кобры - специфического фермента, катализирующего гидролиз 5 @ -рибонуклеотида до рибонуклеозида и ортофосфата. Высокая специфичность 5 -нуклеотидазы делает ее препаратом при исследовании структуры нуклеиновых кислот. Целью изобретения является упрощение способа и повышение чистоты целевого продукта за счет разделения 5 @ -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоноэстеразы. Способ включает растворение яда кобры в буферном растворе с последующим центрифугированием и хроматографированием на гептил-агарозе с использованием в качестве буфера 0,35-0,45 М раствора сульфата аммония, PH 6,5-7,5. 5 -нуклеотидаза элюируется после основного количества белка. Выход - 90%, степень очистки - 25, содержание фосфодиэстеразы и неспецифической фосфомоноэстеразы - менее 0,05% активности 5 -нуклеотидазы. 1 з.п.ф-лы, 6 фиг.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК (51 )5 С !2 N 9 22
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н Д BTOPCHOIVlY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4412358/31 — 13 (22) 18.04.88 (46) 23,02.90. Бюл. 1! 7 (71) Институт химической и биологической физики AH 3CCP (72) А,А. Тара, Э.Э. Аавиксаар и А.А. Аавиксаар (53) 577.15,.07 (088,8) (56) Василенко С.К., Райт В.К. Метод выделения высокоочищенной рибонуклеазы из яда среднеазиатской кобры
Napa oxiana. — Биохимия, 1975, т. 40, Ф 3, с. 578 †5. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ 5 -НУКЛЕОТИДА-
ЗЫ ИЗ ЯДА КОБРЫ (57) Изобретение относится к ферментной промьш!пенности, в частности к по— лучению чистой 5 -нуклеотидазы яда ! кобры — специфического фермента, ката1 ! лизирующего гидролиз 5 -рибонуклеотиИзобретение относится к ферментной промьппленности, в частности к по-! лучению чистой 5 -нуклеотидазы яда кобры — специфического фермента, ка-! тапизирующего гидролиз 5 -рибонуклеотида до рибонуклеозида и ортофосфата
/ (высокая специфичность 5 -нуклеотидады делает ее препаратом при исследовании структуры нуклеиновых кислот), Цель изобретения — упрощение спо-. соба и повыщение чистоты целевого
1 продукта за счет разделения 5 -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоноэстераэы.
„„SU„„1544801 А 1
2 да до рибонуклеозида и ортофосфата.
Высокая специфичность 5 — нуклеотидазы делает ее препаратом при исследовании структуры нуклеиновых кислот.
Целью изобретения является упрощение способа и повьппение частоты целевого ( продукта за счет разделения 5 -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоноэстеразы. Способ включает растворение яда кобры в буферном растворе с последующим центрифугированием и хроматографированием на гептил-агарозе с использованием в качестве буфера 0,35 — 0,45 М раствора сульфата аммония, рН 6,5 — 7,5, 5-11уклеотидаза элюируется после основного количества белка. Выход 90%, степень очистки — 25, содержание фосфодиэстеразы и неспецифической фосфомоноэстеразы менее 0,05% активности 5-нуклеотидазы 1 з,п ф лы I иле
Способ включает растворение яда 4 кобры в буферном растворе с последую- 4 щим центрифугированием при 5000 об/мин Яб и хроматографирование раствора яда на гептил-агарозе, причем растворение рвы яда и хроматографию осуществляют. с использованием в качестве буфера 0,350,45 М раствора сернокислого аммония (рН 6,5-7,5) и 5 -нуклеотидаза элюируется после основного количества бел( ка, полученный раствор 5 -нуклеотидазы концентрируют при ультрафильтрации.
При концентрации сернокислого аммония в элюенте ниже 0,35 М часть
1544801
5 -нуклеотидаэы проходит колонку гепI гил-агарозы, и выход резко понижается. При концентрации сернокислого аммония выше 0,45 начинается адсорбция фосфодиэстеразы на гептил-агарозе, как и при рН выше 7, 5, При рН ниже
6,5,5 -нуклеотидаза инактивируется.
Использование сернокислого аммония в качестве буфера на стадии растворе- 10 ния яда обеспечивает создание подхоДящей среды для последующего разделеия на гептил-агарозе. Концентрация аствора сернокислого аммония 0,35,45 M является самой высокой кон1ентрацией, которая позволяет исклюить адсорбцию остальных нуклеаз (неспецифической фосфомоноэстеразы и фосфоэстер зы), а также является прак тически самой низкой концентрацией, которая обеспечивает полное связыва! ние 5 "нуклеотидазы на. гептил-агарозе и ее элюирование после основного количества белка, Самые лучшие реI зультаты разделения 5 -нуклеотидазы 25 от неспецифической фосфомоноэ стеразы реализуются в интервале рН 6,5-7,5.
Из алкил-агароз оптимальным с орбентом является гептил-агароза. На
< гексил-агарозе 5 -нуклеотидаза связы30 вается слишком слабо, что не обеспе.чивает полноту разделения от компонентов яда и высокий выход, а на октилагарозе частично связывается фосфодиэстераза, и градиентное элюирование не гарантирует полное разделение 5
C нуклеотизады от фосфодиэстеразы, Хро .,матография на гептил-агарозе обеспе чивает практически полное разделение
5 -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоноэстеразы и фосфодиэстеразы (см.чертеж).
Способ заключается в следующем.
Яд кобры растворяют в растворе
0 35-0,45 М сернокислого аммония (рН 45
6,5 — 7,5), центрифугируют при
5000 об/мин при 4 0 в течение 30 мин, 1 осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии.
Хроматографию проводят на гептил-агарозе в растворе 0,35-0,45 M сернокис50 лого аммония (pH 6,5-7,51.5 -Нуклеотидаза связывается на колонке гептилагарозы и элюируется после основного белка 0,35-0,45 M раствором серно55 кислого аммония (рН б, i-7,5) . Полученный фермент концентрируется при помощи ультрафильтрации.Характеристика препарата: выход 90%, степень очистки— в 25 раз„ Содержание фосфодиэ< теразы и неспецифической и <Ьос<ЬомоноэстеI разы ниже 0,05 от активности 5 -нуклеотидазы.
1I р и м е р 1. К, 0 5 г яда кобры добавляют 4 мп раствора 0,35 М сернокислого аммония (рН 6,5), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч о при 4 С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии, На уравновешенную 0,35 М раствором сернокислого аммония (рН
6,5), колонку с гептил-агарозой (размеры колонки 2,1 2,6 см) наносят раствор яда, Колонку элюируют 0,35 М раствором сернокислого аммония (рН 6,5) со скоростью 26 мл/ч, отбирают фракции по 13 мм. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорд-11". Неспецифическая фосфомоноэстераза, фосфодиэстераза, рибонуклеаза и основное количество белка в данных условиях проходят колонку, а 5 -нуклеотидаза, имеющая on( тимум гидрофобности в данных услови ях, связывается на гептил-агарозе и элюируется раствором 0,35 М сернокислого аммония при рН 6,5. Фракции, t имеющие 5 -нуклеотидазную активность, объединяют (выход 310 мл) и концентрируют ультрафильтрацией.
Характеристика препарата: выход
901, степень очистки — в 25 раз, I
Удельная активность препарата 5 -нуклеотидазы 60,0 ед/мг, Содержание фосфодиэстеразы 0,05R (3 10 ед,/мг).
Содержание неспецифической фосфомоноэстеразы 0,05% (3 10 ед./мг)..
Пример 2. К 0,5 г яда кобры добавляют 4 мл раствора 0,40 М сернокислого аммония (рН 7,0), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4 С. Растворенный яд центрифугиру ют при 5000 об/мин при 4 С в течение
30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии, На уравновешенную 0,04 М раствором сернокислого-аммония (рН 7,0) колонку с гептил-агарозой (размеры колонки 2,1 2,6 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,440 М раствором сернокислого аммония (рН 7,0) со скоростью ?6 мл/ч, отбирают фракции по 13 мп, Оптическую плотность элюата регистрируют непрерьпзно с помощью
"Увикорд-11". Неспецифическая фосфо801 6 и основное количество белка проходят в данных условиях колонку,, а 5 -нуклеl отидаза, имеющая оптимум гидрофобности в данных условиях, связывается на гептил-агарозе и ее элюируют раствором 0,45 M сернокислого аммония
Г при рН ?,5, Фракции, имеющие 5 -нуклеотидазную активность, объединяют (выход 307 мл) и концентрируют ультрафильтрацией.
Характеристика препарата: выход
90%, степень очистки — в 25 раз, (Удельная активность препарата 5 -нук" леотидазы 60,1 ед,/мг. Содержание фосфодиэстеразы 0,042Х (2,5 ° 10 ед./мг) 5 1544 моноэстераза, фосфодиэстераза, рибонуклеаза и основное количество бел-, ка проходят в данных условиях колонку и
5 а 5 -нуклеотидаза, имеющая оптимум гидрофобности в данных условиях, 5 связывается на гептил-агарозе и ее элюируют 0,40 И сернокислого аммония при рН 7,0. Фракции, имеющие 5 -нуклеотидазную активность, объединяют (выход 305 мл) и концентрируют ультрафильтрацией. Удельная активность (/ препарата 5 -нуклеотидазы 60,7 ед,/мг.
Характеристика препарата: выход
90Х, степень очистки — в 25 раз. Со-. держание фосфодиэстеразы 0,046Х (2,8% хЕ0 ед./мг). Содержание неспецифической фосфомоноэстеразы 0,00073 (4,5.10 ед./мг)
II р и м е р 3. К 0,5 r яда кобры 20 добавляют 4 мп раствора 0,45 М сернокислого аммония (рН 7,5), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4 С. Растворенный яд центрифугио руют при 5000 об/мин при 4 С в тече- 25 ние 30 мин, Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии. На уравновешенную
0,45 М раствором сернокислого аммония (рН 7,5) колонку с гептил-ага- 30 розой (размеры колонки 2,112,6 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,45 М раствором сернокислого аммония (рН 7,5) со скоростью .
26 мл/ч, собирают фракции по 13 мл, Оптическую плотность элюата регистри»
35 руют непрерывно с помощью "Увикорд11 Неспецифическая фосфомоноэстераза, фосфодиэстераза, рибонуклеаза
Формула и з обретения
Г
l . Способ выделения 5 -нуклеотидазы.из яда кобры, включающий растворение яда кобры в буферном растворе, центрифугирование с последующей очисткой супернатанта методом хроматографии с разделением от сопутствующих белков, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения чистоты целевого
t продукта за счет разделения 5, -нуклеотидаз от неспецифической фосфомоноэстеразы, растворение яда кобры осуществляют в 0,35-0,45 М буферном растворе сульфата аммония при рН
6,5-7,5, а хроматографическую очистку выполняют на гептил-агарозе в:
0,35-0,45 M растворе того же буфера.
2. Способ по п.l, отличаюшийся тем, что центрифугирование проводят при 5000 об,/мин.! 54480) Корректор Н. Король
Заказ 47) Тираж 479 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
118035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-и брательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101
Составитель А, Семенов
Редактор В. Данко Техред М.Дидык
800
Оэг, мл! !