Способ выделения ферредоксина

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (51)4 С 12 N 9 02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3883738/28-13 (22) 10.04.85 .(46) 07.09.86. Бюл. 9 33 (71) Институт почвоведения и фотосинтеза АН СССР (72) В. К. Гипс и E. Н. Мухин (53) 557.15(088.8) (56) Мухин Е. Н., Гннс В. К. Выделение ферредоксина из листьев теплолюбивого растения Cucumis sativus

Биохимия, 1972, т. 37, вып. 5, с. 1012-1018.

Gravford С., Zeusen R. С. Isola, tion and Partial. Characterization of

Ferredoxin from Zea mays. — PIaut

Physiology. 1971, 47, р. 447-449. (54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРРЕДОКСИНА из высших растений, включакнций гомогенизацию сырья и стадии очистки: фракционирование сульфатом аммония, гельфильтрацию на сефадексе и ионнообменную хроматографию на

ДЭАЭ-целлюлозе, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и сокращения времени его выделения из высших растений, используют листья 4-5 - недельных растений семейства злаковых, бобовых или тыквенных, .а гомогенизацию сырья проводят в буфере при массовом соотношении листья:буфер 1 5 с добавлением 0 35- 3

0,50 М НаС1 и 0,01 - 0,02 М меркаптоэтанола.

1О !

20

1 12

Изобретение относится к биохимии, а именно к способу получения высокоочищенных ферментных препаратов, и может быть использовано н производстве ферментных препаратов, а также в научных исследованиях по биохимии и физиологии растений, молекулярной биологии °

Целью изобретения является повышение фотовосстановительной активности, увеличение выхода целевого продукта и сокращение времени его вы" деления.

Цель заключается в том, что согласно способу выделения ферредоксина из высших растений, включающему гомогенизацию сырья и стадии очистки: фракционирование сульфатом аммония, гельфильтрацию на сефадексе и ионнообменную хроматографию на ДЭАЗ-целлюлозе, используют листья 4-5-.недельных растений, гомогенизацию сырья проводят в буфере в соотношении 1:5 с добавлением 0,35 — 0,50 М NaC1 и

0,01 - 0,02 M меркаптоэтанола.

Пример 1, Свежие листья 45-недельных растений гомогенизируют в буфере н соотношении 1:5 с добавлением 0,35"0,50 М NaC1 и 0,01

0,02 M меркаптоэтанола. Гомогенат отжимают и проводят фракционное нысаливание с последующим центрифугированием, Первый осадок отбрасывают.

Второй осадок используют для получения ферредоксина, который растворяют в трис-НСI буфере и обессоливают на сефадексе G-50. Дальнейшую очистку ферредоксина проводят с использованием двухкратной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

Пример 2, Растения пшеницы сорта Московская 35 выращивают н открытом грунте, Навеску свежих листьев (четырехнедельные растения)

100 г гомогенизируют в 500 r буферной смеси следующего состава, M: трис-НСI 0,05 (pH,8,2); 0,35 NaC1;

0,01 МЭ (т.е. в соотношении 1:5), в гомогениэаторе в течение 2 мин, Полученную темно-зеленую массу фильтруют через полотно, Фракционное осаждение балластных

:белков проводят из гомогената листьев, добавляя соль из расчета 25 г сульфатааммония на 100 мл раствора. После центрифугиронания при 6000 QG/ìèí в течение 10 мин осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют 36 r

55640 2 сульфата аммония и через 10 мин центрифугируют при указанном режиме в течение l0 мин. Осадок, содержащий ферредоксин, растворяют в 40 мл

0,05 М трис-HCl буфере, 0,01 M M3, рН 9 и центрифугируют при 6 тыс. об/мин н течение 5 мин для удаления балластных белков. Супернатант подвергают обессоливанию и очистке от высоко- и низкомолекулярных веществ путем фильтрования через колонку (40 х 4,0 см) с сефадексом G-50, уравновешенную 0,05 М трис-НС! рН 8,2, 0,01 М МЭ. Белок элюируют тем же буфером.

Обессоленный белковый растнор с ферредокснноной активностью наносят на колонку размером (3 х 5 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной

О 9 05 М трио-НС 1 буфером рН 8 ° 2

0,3 М НаС1, 0,01 М МЭ. Колонку последовательно промывают 0,05 M трисНС1 буфером рН 8,2 с добавкой 0,1 М, 0,15 М ИаС1, Ферредоксин злюируют

0,1 M трис-НС1 буфером с добавкой

0,17 М NaC1, Ионнообменную хроматографию проводят повторно на колонке (lхl см) с ДЭАЭ-целлюлозой, Феррео доксин хранят при О С под азотом

30 или в замороженном состоянии при

20 С н течение длительного времени без потери активности.

В табл. 1 приведены результаты получения фелка из 100 г листьев пшеницы сорта Московская 35, Гомогенность выделяемых белков

l доказана седиментационным раннонесием на аналитической ультрацентрифуге, модель Е, при электрофореэе н 1ОХ-ном полиакриламидном геле.

Активность ферредоксина определяют по скорости фотовосстановления

НАДФ хлоропластами пшеницы в реакционной смеси следующего состава: мкмоль М8С1 10; НАДФ 0,6; ферре оксина; 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 8,2), 10 g -хлорофилла, Пример 3. Выделение ферредоксина из листьев пшеницы ведут аналогично примеру 1, но с использованием механического измельчения замороженных листьев в соотношении листья:буфер 1:2 и без добавок, снижают выход белка в 1,5 — 2 раза и активность в 1,5 раза.

Пример 4. Выделение ферредоксина из листьев люцерны, выращенной в открытом грунте, ведут анало)255640

Таблица 1

X от исОбщий белок, мг

Активность ферредоксина, мкмоль НАДФН

С т адии очи с тки и выделения фермента ходного белка мг хф ч

Гомогенат из листьев

2500

100

1540

61,6

Второй осадок

Сефадекс G-50

780

31,2

ДЭАЭ-целлюлоза

110

4,4 - 80

0,08 200

ДЭАЭ-целлюлоза гично примеру I. Выход ферредоксина

3 5 — 4 мг на 100 г листьев с фотовосстановительной активностью мкмоль НАДФН мг хф ч

Пример 5. Выделение ферредоксина из листьев гороха, выращенного в открытом грунте, ведут аналогично примеру 1. Выход ферредоксина

3-3 5 мг íà 100 г листьев с фотовосстановительной активностью 120 мкмоль НАДФН мг хф ч

Пример 6, Выделение ферредоксина из листьев огурцов, выращенных в открытом грунте, ведут аналогично примеру 1. Выход ферредоксина

3,0-3,5 мг на 100 r листьев с фотовосстановительной активностью мкмоль НАДФН мг хф ч

В табл. 2 дана активность предлагаемого ферредоксина и выход белка из 100 г листьев пшеницы сорта

Московская 35, люцерны, огурцов, г0роха в сравнении с известным.

Пример 7. Граничные и оптимальные значения NaCI 0,35-0,5 M u меркаптоэтанол 0,01-0,02 М, Результаты опытов даны в табл, 3.

Пример 8. Запредельные значения параметров.

При изменении каждого из параметров все остальные оптимальны (как в примере 1).

Результаты даны в табл. 4, Пример 9, Влияние соотношения зеленый материал:буфер на выход выделенного белка показано в табл. 5.

Пример 10, Выход ферредоксина в зависимости от возраста растений дан в табл. 6.

Пример 11. Сокращение вреI мени получения предлагаемого ферредоксина за счет исключения и сокращения ряда операций позволяет провести весь процесс за 4,5-5 ч, тогда как известного за 30-48 ч.

Результаты опытов даны в табл. 7.

Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с известным является использование комбинации стадий очистки — гомогенизации сырья в буфере при массовом соотношении листья:буфер 1:5 с добавлением

0,35 М вЂ” 0,5 М и 0,01 — 0,02 М меркаптоэтанола в сочетании с фракционным осаждением сульфатом аммония, что позволяет увеличить выход целевого продукта в 1,5 — 2 раза с полу 11 чением более высокоактивного ферредоксина с высокой степенью чистоты и сократить время его получения до

4,5 — 5 ч.

1255640

Таблица 2

Активность ферредоксина в реакции фотовосстановления НАДФ хлоропластами, мк моль НАДФН согласно мг хф ч способу

Листья выс растений известному предлагаемому предлагаемому известному

Люцерна

220

110

3 5=4 0 2 0 2 ° 5

Пшеница сорта

Московская 35

3 5-4,1

220

1, 8-2,0

120

180

Таблица

Характеристики

Концентрация, М

0,35 0,42 0,50

0,01 0,015 0)02

NaCl

Мер капто э т анол

Выход, мг

100 r листьев пшеницы мкмоль НАДФН

Активность, мг хф ч

200 200 180

Таблица 4

Активность, Выход,! 00 г сырь1х%истьев — - — — — --— мк моль НАДФН ига хф ч

Ре агент

Концентрация, М

NaCI

0,3

3,1

200

190 0,55

3,0

Иеркаптоэтанол

0 05

3 5

150

0,25

3,9

160

Горох

Огурцы

Выход целевого продукта из

100 г листьев, мг, согласно способу

3,0-3 5 1,5-2,0

ЗеО Зв5 1 ° 5"1у8

1255640

Та блица 5

Выход белка

Соотношение листья:буфер

1:6

Очень сильное разбавление белков, экстрагируемых из листьев, что влечет за собой потерю до 10Х белка.

Трудно работать на центрифуге с большими объемами раствора белков.

1:2

Ферредоксин извлекается из листьев не полностью

1:3-1:5

Эти значения оптимальны для 100% выхода ферредоксина

Таблица 6

Растения

Выход ферредоксина мг

00, по способу известному предлагаемому

Люцерна двухнедельные проростки

I, 5-2

2,2-2,5

4-5-недельные растения

3 5-4

Горох двухнедельные проростки л

1,5-2

2,2-2,6

4-5-недельные растения

3,0-3 5

Огурцы двухнедельные проростки

2,2-2,4

4-5-недельные растения

3,0-3,5

4.

Эти определения авторы раньше не проводили (с растениями 4-5-недельного. возраста).

Характеристики известного предлагаемого

Иэмельчение матери0-10

2-00

Экстракция (размораживание) 2-00

0-5

2-00

Первое высаливание

Центрифугирование

0-10

1-00

Второе размораживание

0-10

12-00

0-10

1-00

Центрифугирование

Обессоливание на сефадексе

3-00

G-50 мелкий

G-50 средний

1-00

3-00

2-00

I колонка

1-00

2-00

П колонка

Сефадекс G-75

2-00

30-00

5-00

Общее время

Составитель В. Соина

Техред Л.Олейник Корректор И, Эрдейи

Редактор Н. Гулько

Заказ 4787/29 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35,.Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Ионнообменная õðîматография на

ДЭАЭ-целлюлозе

1255640 l0

Таблица 7

r, Время основных операций, ч-мин, для способа