Способ получения молибдокофактора

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения молибдокофактора (Мо-ко), и может быть использовано в энзимологии и медицине. Цель изобретения - упрощение процесса получения молибдокофактора и повышение чистоты целевого продукта. Способ заключается в выделении молибдокофактора непосредственно из экстракта отрубей зерен пшеницы. Отруби экстрагируют буферным раствором, экстракт обессоливают для отделения низкомолекулярных тиолсодержащих соединений и обрабатывают мочевиной или додецилсульфатом натрия для денатурации белков и отделения Мо-ко. Мо-ко адсорбируют на тиолсефарозе, а элюцию проводят 2-меркаптоэтанолом, который затем отделяют упариванием. Полученный препарат Мо-ко гомогенен при тонкослойной хроматографии, что свидетельствует о высокой степени его чистоты. Упрощение процесса в основном заключается в том, что выделение Мо-ко осуществляется непосредственно из экстракта отрубей, а не из предварительно очищенного препарата белка (или фермента), содержащего Мо-ко.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКСМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ" СССР (21) 4300601/31-13 (22) 3 1.08.87 .(46) 07.11.89. Бюл. У 41 (71) Институт молекулярной биологии и биохимии АН КазСССР (72) 3.А.Аликулов и Б.M.Áåñáàåâà (53) 577.15(088 ° 8) (56) Johnson J, L., Rajagopalan К.V. PNAS USA, 1982,79, р. 6856-6860.

Mendel R.R,, Alikulov Z.À.

J.Chromatography, 1983, 267, р. 409-413. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛИБДОКОФАКТОРА (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения молибдокофактора (Mo-ко), и может быть использовано в энзимологии и медицине. Цель изобретения — упрощение процесса получения молибдоко-фактора и повышение чистоты целеИзобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получейия молибдокофактора (Мо-ко) и может быть использовано в энзимологии, в медицине.

Цель изобретения — упрощение процесса получения Мо-ко и повышение чистоты целевого продукта.

Способ заключается в выделении

Мо-ко из отрубей зерна пшеницы. Отруби обрабатывают буферным раствором для экстракции белков, содержащих связанный Мо-ко, а затем полученный экстракт обессоливают для отделения

„„SU, 1520097 А 1 (5I)4 С 12 N 1 1/00 С 07 D 475/00

2 вого продукта. Способ заключается в выделении молибдокофактора непосредственно из экстракта отрубей зерен пшеницы; Отруби экстрагируют буферным раствором, экстракт обессоливают для отделения низкомолекулярных тиолсодержащих соединений и обрабатывают мочевиной или додецилсульфатом натрия для денатурации белков и отделения Мо-ко. Мо-ко адсорбируют на тиолсефарозе, а элюцию проводят

2-меркаптоэтанолом, который затем отделяют упариванием. Полученный препарат Мо-ко гомогенен при тонкослойной хроматографии, что свидетельствует о высокой степени его чистоты. Упрощение процесса в основном заключается в том, что выделение

Мо-ко осуществляется непосредственно из экстракта отрубей, а не из предварительно очищенного препарата белка (или фермента), содержащего Мо-ко. низкомолекулярных соединений, способных связываться с тиолсефарозой.

Содержащиеся в экстракте белки обрабатывают 8М мочевиной или 17-ным додецилсульфатом натрия для отщепления

Мо-ко и переведения его в растворимое состояние. Затем проводят связывание Мо-ко на тиолсефарозе и элюцию целевого продукта 2-меркаптоэтанолом. В предлагаемом способе отсутствует процедура выделения очищенного препарата белка, содержащего Мо-ко, так как выделение

Мо-ко проводится из практически не 1520097 очищенной смеси различных белков, что существенно упрощает процесс . очистки Мо-ко. Замена прогревания на обработку денатурирующими реагентами позволяет избежать изменений

Мо-ко и образования неактивных форм этого вещества, что в конечном итоге увеличивает чистоту целевого продукта. Проведение элюции 2-меркаптоэтанолом, который в отличие от использовавшегося ранее глутатиона может быть легко отделен упариванием, также повышает чистоту целевого продукта.

Пример. 20 r отрубей зерна пшеницы смешивают с 100 мл 100 мМ

Na-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 0,5М NaC1, 1 мМ аскорбиновой кислоты. Эту суспензию центрифугируют при 1200g в течение 10 мин на холоде (4 С) . Супернатант пропускают через сефадекс

G-25 (или С-50) для удаления низкомолекулярных тиолсодержащих соединений экстракта, которые также могут связаться с сефарозой. В белковый пик экстракта добавляют мочевину до 8М или SDS до 1Ж для денатурации белковой молекулы и выхода Мо-ко в раствор. Результаты, полученные при использовании двух денатуратов, идентичны.

r сухого геля тиолсефарозы 4В (сефарозаглутатион-2-пиридилдисульфид) замачивают в дегазированном

100 мМ Иа-фосфатном буфере. Соотношение буфера к гелю 200 мл/1 г. Гель готов к использованию через 15 мин.

его помещают в целлофановый мешок (2х30 см), который перед диализом сплющивают в ленту, чтобы максимальное количество гранул тиолсефарозы соприкасалось с мембраной. Это позволяет достичь наибольшего доступа, кофактора, проникающего через мембрану к всем гранулам сефарозы. 3атем целлофановый мешок с тиолсефарозой помещают в раствор источника

Мо-ко (экстракт отрубей).

Сосуд с раствором, где проводится диализ, тщательно дегазируют и заполняют азотом. Диалиэ проводят до полного насьнцения сефарозы кофактором, периодически обновляя источник

Mo -ко (через каждые 30 мин) .

Насьпцение сефарозы определяют сле дующим образом. Кроме большого целлофанового мешка в раствор источника

55 ляется Мо-ко, представляющим собой производное птерина, содержащее две сульфогидрильные и одну фосфатную группы.

Мо-ко помещают 10-15 маленьких мешочков с тиолсефарозой и через определенные промежутки времени (3045 мин) снимают их по одному, элюируют Мо-ко 2-меркаптоэтанолом.

Полное связывание Мо-ко с тиолсефарозой подтверждается отсутствием следов 2-тиопиридина при последующей элюции связанного кофактора

2-меркаптоэтанолом. Содержание 2-тиопиридина контролируется спектрофотометрически при длине волны 343 нм.

Сефароза насьнцается полностью в течение 2,5-3 ч диализа. Во время диализа экстракт отрубей обновляется свежими порциями через каждые 3045 мин, так как отделяющийся от белка Мо-ко, не достигнув сефарозы, инактивируется в условиях диализа (т.е. при комнатной температуре) .

Связывание протекает с одинаковой эффективностью в аэробных и анаэробных условиях. После насыщения кофактором сефарозу промывают несколько раз указанным буфером, содержащим

1M NaCl. Затем тщательно промывают дистиллированной водой.

Иммобилизованный на тиолсефарозе

Мо-ко сохраняет 90% активности по отношению к исходному в течение

2 мес., тогда как препарат Мо-ко в растворе д(в буфере) инактивируется полностью в течение 10-12 ч даже в анаэробных.условиях. Лиофильное высушивание сефарозы с иммобилизованным кофактором и хранение на холоде о (4 С) позволяют сохранить активный

Мо-ко до 1,5 лет.

Элюция Мо-ко с тиолсефарозой осуществляется 2-меркаптоэтанопом, причем последний легко отделяется от

Мо-ко упариванием.

Полученный препарат Мо-ко гомогенен по данным тонкослойной хроматографии в различных условиях, причем значения Rj у полученного предлагаемым и известным способами Мо-ко идентичны. Содержание сульфогидрильных групп, фосфата, а также флуоресцентные характеристики полученного

Мо-ко не отличаются от соответствунпцих характеристик известного Мо-ко.

Эти данные свидетельствуют, что выделенное органическое соединение явФормула из обретения

Способ получения молибдокофактора, включающий обработку исходного сырья, содержащего связанный с белками молибдокофактор, отщепление моСоставитель В.Иуронец

Редактор И.Дербак Техред M.Õoäàíè÷ Корректор А.Обручар

Заказ 6723/29 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 152

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет упростить процесс выделения Мо-ко за счет исключения стадий выделения белков, содержащих Мо-ко, и стадий дополнительной очистки Мо-ко, а также получить препарат, не содержащий неактивных продуктов деградации Мо-ко и глутатиона.

0097 6 либдокофактора от белков, его связывание с тиолсефарозой и элюцию целевого продукта тиолсодержащими соединениями, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения чистоты целевого продукта, в качестве исходного сырья используют пшеничные отруби, которые

10 обрабатывают буферным раствором и полученный экстракт обессоливают, отщепление молибдокофактора от белков осуществляют обработкой додецилсульфатом натрия или мочевиной, а элюцию целевого продукта проводят раствором 2-меркаптоэтанола.