Способ разделения гепатоцитов

 

ИзоС рётенцр относится к бнотехпологии, ,я имоино к способам отделения /кпяисспособных гепатоцитов от попрсх денны:-:. Целью изобретения является увеличение пмхопа жизнеспособных клеток, Сусненямю гепатоцитов в изото}гичес 1;пй сахярозе, содержащую 0,8 мМ MgCl, КС1, 1,6 мМ , 0,4 мМ , 1,2 мМ CaClj н 1% альбумина,центрифуг прутт при 50 g n течение. 4 мин. При зтом суспенчир клеток разделяется на 2 фракции: нижнюю, более темгд ую, и верхшою, светлую. Фракции разл.еляют, после с --спендируют в солевом растворе и смтррде.ттяют жизнеспособность , Инт;) клетки содержатся в нижней, фракции . 1 табл.

(5!) 5 С 12 N 5/00

4 о 1 !

k yy) г, 1 ", ., / . ф фф СО!03 СОБЕТСНИХ ",, : ф !:,: сссиасистичксних .-и-- /

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

110 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbfT Èßì

ПРИ ГННТ СССР (46) 07.06.92.Бюл. !". 21 (21) 4272263/14 (?2) 29.06.87 (7l) Институт пробле.-1 криобиологии и криомедицигн,> АН УССР (7?) h, Ï.Ïeòðåíêo, A.H. Ñóêà÷ и Л;П.Кравченко (53) 61?:015(088.8) (56) In vitro, 1985, v, ?1, 1й 9, р. 526-530„

1 54) C1TOCO11 Ph 3illË Ë È. 1 ГКПА Ж ЦИТО В (57) изо! р -.elllle относится к биоTexnoëorIln, а именно v, способам OTделения жизгие пособных гепатоцитов от попрсжденны-.. Целью изобретения

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам отделения жизнеспособных гепатоцитов от поврежденных.

Целью изобретения является увеличение выхола жизнеспособных клеток за счет разделения клеток в изотонической сахарозной среде при следующем содержании компонентов: 250 мМ сахарозы, 5 мМ КС1, .0,4 мМ КН РО,г, 1,6 мМ 11а НРОг, 0,8 мМ 1!gCI, 1,2 мМ

СаС1, 1Х альбумина.

Пример 1. Перфузию печени крыс-самцов массой 200-250 r проводили in sitII, Лля этoro брюшную полость анестезированного тиопенталом животного вскрывали, вводили ннъекционную иглу в воротную вену, и закрепляли лигатурой, а верхгво1о полую подсекали в месте ответвления правой почечной вены для оттока является ув личенис лыхопа жизнеспособных клеток, Суспензию гепатоцитов в изоionH÷eñêoé сахарозе, содержащую 0,8 мМ NgCI, 5 и" КС1, г

1,6 мМ 1 атНРО, О, 4 мМ КН ГО, 1,; мМ СаС1„и 17, альбумина, центрифугируют при 50 g в гечение 4 мин.

При эт ом суспеп. ия и леток ра эпеляется на 2 фракции: нижнюю, более темную, и верхнгою, светлую. Фракции разделяют, после чего счсг1ендируют в соленом растворе и опрг дгляют жиз— неспособность. Интактные клетки содержатся в нижней, 6oJI(е темпе и фракции. 1 табл, .перфузата. На первом этапе печень отмывали от крови со скс ростью 2535 мл/мин раствором, содержащим

140 мМ NaC1, 5 м1! КС1, 3 мМ ИаНСЪ, 27 мМ лимоннокислого натрия, который насыщали газовой смесью 95г О и 5Е

СО до рН 7,4 в течение 10 мин при

37 С со скоростью 25-35 мл/мин. На втором этапе перфузи1о проводили с той же скоростью в течение ?0-30 мин.

На этом этапе в среду вводили ЭДТА до конечной концентрапии 2 м. !. После окончания перфузии печень извлекали из брюгпной полости, быстро охлаждали до О С и измельчали ножница..1и в среде, содержап ей 250 и1! сахарозы, 5 мМ

КС1, 1,6 мМ 1аНРО, О, 4 мМ КН, РО+, 0,8 мМ М@С1, 1,2 мМ СаС1, 17, альбумина (рН 7,4). Кусочки ткани подвергали вибрации в охлажленнс и сахарозно-солевой среде с частотой 50 Гц (количество жизнеспособных клеток) ° 100X общее количество клеток 25 и 19,6Я по известному способу, . т.е. вьппе на 443 по предлагаемому способу.

Жпэне экp,g / /egк!

Г„ ущ, нмоль jugs нмоль

Од /10 кл/мин О /10 кл/мин

Фракция способность, 22,7 2,1 1,33+0,1

Нижняя 10 93 «+ 2

Верхняя 5 3 !

17,7+2,2

1132иОэ 7

Составитель Л. Сабурова

Техред А.Кравчук Kоpрeктор В.Кабаций.Редактор A. Копдрахина

Заказ !773/ДСИ Тираж 367 Подписное

В1{ЦН!!11 Государственного комитета по изобретениям B открытиям прп ГЕНТ СССР

113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д, 4/5

Ф! ае

Производстве нно — издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул, Гагарина, 101

3 1510356 в течение 60 с с помощью устройства, электродвигатель которого приводит в возвратно-поступательное движение пестик. Полученную после вибрации суспенэию клеток фильтровали через нейлон и центрифугировали при 50 g в течение 4 мин. При этом суспензия клеток разделилась на 2 фракции: нижнюю, более темную, и верхнюю, свет- 10 лую. Фракции разделяли, после чего суспендиравали в солевом растворе, содержащем !40 мМ 11аС1, 5 мМ КС1, 0,8 мМ МВБО+, 1,6 мМ Ба !!РО, 0,4 мИ

КН РО, 25 мМ ИаНСО, мИ СаС1 (рН 7,4).

Полученные после промывки клетки исследовали. Жизнеспособность определяли методом окрашивания трипаноBblM синим, скорость эндогенного ды- 20 хания (, 1 ) в отсутствие и присутщ

Формулаиэобретения30

Способ разделения гепатоцитов путем дезагрегации печени, фракционирования полученных клеток в среде разделения на две фракции, отделения

35 нижней фракции .с последующей очисткой гепатоцитов промъ.ванием в соленом

4 стаи сукцината (5 мМ) определяли полярографически. Результаты представлены в таблице.

Нз габлицы видно, что в нижней фракции находятся интактные клетки (жизнеспособность 933), обладающие высоким зндогенным дыханием; Зндогенное дыхание клеток нижнего слоя слабо стимулируется сукцинатом, в норме не проникающим через плаэматическую мембрану.

В верхнем слое большинство клеток прокрашивается трипановым сипим, эндогенное дыхание в 8 раз ниже, чем в клетках нижней фракции. Сукцииат стимулирует дыхание более чем в 11 раз.

Выход жизнеспособных клеток из всей печени в процентах составил

28,37. по предлагаемому способу растворе, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода жизнеспособности клеток, фракционирование проводят в изотонической сахарозной среде при следующем содер-; жании компонентов: 250 мМ сахарозы, 5 мИ хлористого калия, 0,4 мИ фосфорнокислого калия одноэамещенного, -1,6 мИ фосфорнокислого натрия. двузамещенного, 0,8 мИ хлористого магния, 1,2 мИ хлористого кальция, 1Х альбумина,