Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент моноклональных антител к са @ /mg @ - зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в экспериментальной и клинической медицине. Цель изобретения - получение гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к CA<SP POS="POST">2+</SP>/MG<SP POS="POST">2+</SP> -зависимой эндонуклеазе лимфоцитов селезенки человека. Штамм DS получают путем слияния клеток селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных экстрактом клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, содержащим фермент CA<SP POS="POST">2+</SP>/MG<SP POS="POST">2+</SP> -зависимую эндонуклеазу, и миеломы линии X63.AG8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N117Д и продуцирует антитела JGG<SB POS="POST">2</SB> класса. Секреция антител на 4-й день культивирования 10-20 мкг/мл среды и 1-3 мг/мл асцитической жидкости. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (д1) у С. Q N 5/00, А 61 K 39/395

6 с с- с," с f с- ч I M 4 сс ЙД

ЖЕ; 7 :-.:, .,.. ., .„ . с.-. 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н д BT0PCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Первая схема. Мьппей линии BALB/c, .самцов массой 18-20 г иммунизируют подкожно в 5 точек с использованием полного адъюванта Фрейда в дозе

100 мкг белка на мышь. Через 10 дней мышей иммунизируют повторно внутрибрюшинно в дозе 100 мкг, еще через

10 дней внутривенно вводят 200 мкг белка. В течение 6 мес. мьппи отдыхают, затем их иммунизируют внутривенно -в дозе 100 мкг белка на мьппь и через неделю проводят разрешающую иммунизацию внутриселезеночно в дозе

100 мкг белка. На 3 день клетки селезенки иммунизированных мышей берут на гибридизацию.

Вторая схема. Мышей той же линии иммунизируют дважды экстрактом клеГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

l1O ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4299247/31 13 (22) 04.06.87 (46) 30.07.89. Бюл. № 28 (71) Институт медицинской генетики

AMH СССР и Институт медицинской энзимологии АМН СССР (72) А.И. Волгин, В,В. Волгина, Н.Н. Ходарев, И.И. Вотрин и Л.А. Певницкий (53) 578.085.23(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1414870, кл. С !2 N 5/00, А 61 К 39/395, 30.03.87. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ NUS NUSCULUS — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

К Са /Mg +-ЗАВИСИМОИ ЭНДОНУКЛЕАЗЕ

КЛЕТОЧНЫХ ЯДЕР ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ

ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в экспериментальной и клинической медицине.

Цель изобретения - получение гибри1 домы, продуцирующей моноклональные антитела к Ca«/Мя -зависимой эндоg4. нуклеазе лимфоцитов селезенки человека.

Ф

Штамм получают следующим образом.

Штамм является продуктом слияния кле:ок селезенки мышей линии BALF/с и миеломы линии ХЬЗ.Ag8.653, Мьппей иммунизируют экстрактом клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, содержащим фермент Са /Ng -зависип4мую эндонуклеазу. При этом используют две схемы иммунизации.

„„SU,, 1497214 Д 1. (57) Изобретение относится к гибри домной технологии и может быть исПользовано в экспериментальной и клп— нической медицине. Цель изобретенп". —— получение гибридомы. пролуцирующей

+ + моноклональные антитела к Са- /Ng зависимой эндонуклеазе лимфоцитов селезенки человека. Штамм DS получают путем слияния клеток селезенки мышей линии ВА В/с, иммунизированнь.х экс трак. ом кле i оч,ы < ядер лтсr!Aov,; — тов селезенки человека, содержащим с . +фермент Са /Мя -зависимую -.и о.нуклеазу, и миеломы линии ХЬЗ.Лд8.65", Штамм депонирован под номерам ВСКК (П) № 117Д и продуцируе". а титела

IgG< класса. Секреция антител на

4-й день культивирования 10-:0 мкг/мл среды и 1-3 мг/мл асцитической жидкости. 1 табл.

149721 точных ядер лимфоцитов селезенки -eJ! îBeêà с интервалом 7 дней. Антиген вводят внутриселезеночно в дозе . 100 мкг по белку, Гибридизацию лимфоцитов селезенки человека мьппей с миеломными ".летками npoi3näÿò на

4 сут. Для слияния используют клетки миеломы ХбЗАд8.6539 находящиеся в логарифмической фазе роста. Мышей забивают цервикальной дислокацией, асептически извлекают селезенку и готовят суспензию клеток с помощью гомогениэации в гомогенизаторе Поттера о 3$

Слияние клеток осуществляют следующим о бра з ом .

Суспензию миеломных клеток и лимфоцитов смешивают в плоскодонном стеклянном флаконе в соотношении О

I;1O. Флакон центрифугируют 200 g

5 мин, удаляют супернатант и к осадку клеток приливают по каплям 2 мл

507-ного раствора полиэти. енгликоля (М.В, 1500). Клетки суспендируют лег- 25 ким встряхиванием флакона. ЧерЕз мин во флакон доливают 10 мл среды DNEN, затем в течение 3 мин еще

50-60 мл. Флакон центрифугируют

200 g 5 мин, удаляют супернатант и ЗО осадок клеток ресуспендируют в 60 мл среды DNEN, 157. фетальной сыворотки.

Клетки инкубируют во флаконе при

37 С 6-12 ч. После инкубации среду ьо флаконах заменяют на селективную среду ИИМ-ГАТ, содержащую гентамицин

80 мг/мл,гипоксантин 5 10 М, аминоптерин 2 10 М„ тимидин 8 10 N.

Клетки в концентрации 2-3 ° 10 /мл распределяют по лункам 96-луночных 910 планшетов, дно которых предварительно покрывают фидерным слоем сингенных перитонеальных макрофагов (69 п10 клеток на лунку). Клетки кульо тивируют в планшетах при 37 С в атмосфере 57 СО и 967. влажности. Среду меняют каждые 3 сут на 507.. Массовая гибель клеток отмечается на 3-6 сут культивирования на селективной среде, рост гибридов наблюдается на 5-7 сут, первое тестирование супернатантов проводят на 10 день культивирования после гибридизации. Гибридные клетки культивируют на среде DNEN с добавлением 15% фетальной сыворотки, гентами55 цина, гипоксантина, аминоптери"a9 тимидина в течение ЗО дней„ затем в течение TO дней на среде ЖМЕМ с 157. фетальной сыворотки, гентамицином9 гипоксантином, тимиФ дином. Дальнейшее культивирование осуществляют на среде DNEM с 157. фетальной сыворотки и гентамицином.

Клонирование гибридом проводят методом лимитирующих разведений, Б результате тестирования супернатантов от 200 культур, полученных в результате слияния миеломы с лимфоцитами мышей, иммунизированных по первой схеме, получено 8 позитивных линий гибридомных клеток, по второй схеме иммунизации — 13 позитивных клонов из 200 первичных культур. Бсе стабильные позитивные линии клонированы и заморожены в жидком азоте. Клон DS клонирован еще 5 раз.

Для наработки антител клон DS культивируют в условиях zn v vo в виде асцитной жидкости в брюшной полости сингенных мышей.

Штамм депонирован под номером

ВСКК (П) Р 117Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирования. Среда для культивирования — сре. да Дульбеко с добавлением 107. телячьей эмбриональной сыворотки., 4 мм

Т-глутамина. 80 мкг/мл гентамицина

О

37 С. 57. СО 9 967. влажности. Допустимо использование среды Игла.с добавлением 157. сыворотки крупного рогатого скота.

Для выращивания штамма используют стеклянную или пластиковую посуду.

Во флакон объемом 25 мл в 5 мл среь ды вносят 2 10 -10 клеток штамма

DS. Пассаж 1 раз в 3-4 дня той же дозой клеток. Кратность рассева 1:4.

Культивирование в организме живот ного, Для выращивания опухоли из штамма используют мышей линии

BALB/ñ. Свежим мьппам за 7-30 (оптимально 14) дней до инъекции штамма вводят внутрибрюшинно 0,5 мл пристана, затем инъецируют по 3,2:106 клеток на мьппь в 1 мл среды Игла. Асцитическую жидкость собирают на 1015 день. Из асцита перевивают на свежих мышей по 1-5 10 клеток на

1 мышь9 4-6 пассажей.

Характеристика получаемого продукта. Моноклональное антитело (монАТ) относится к IgGп мыши, фиксируют белок А. Способны связывать

Оа /Мд -зависимую эндонуклеазу г+

4 клеточных ядер спленоцитов человеке,Испо. 1ъ заваннс !Итам а 3l. I„ .Ûc тр;.р(— ется следующим примером.

Пример. Пластин 96 — луначнай пластинки покрывают белком А, за". ем вносят. тестируемые образцы культуральной среды штамма DS. После взаимодействия монАТ с белкам А лунки промывают и вносят экстракт клетачных ядер силеноцитов человека или очищенный экстракт Са " /, 1g" 4 -зависи— мой эндонуклеазы. После того, как монАТ-свяжут фермент, n,oáàâëÿþò суперспиральную ДНК плазмиць "„ ВН 32" в качестве субстрата ; фермсн-;;-...

Палолмтельную реакцию апред;анют по гидрализу су ерспиральнсй Лор.1ь; плазмиды после электрофарстичес; ог;анализ.-. продуктов расщепления @ К

Са / 1у -зависимой эндануклеазай, фиксирсванной монАт.

ИонАТ ПВ могут быть использованы как я количественного апрепеления

Са +/Hg - -зависимсй эндануклеазы, так и для определения ее активности В комплексе антиген-антитело в экстрактах тканей и био.алогических жидкостях.

Результаты связывания антител л штамма DS с о ищенной Са I.-, -зависимой эндонуклеазай следующие: и а. Ъ

Активность .а / 1р

Антитела зависимой эндснуклеазы, сарбированной на антитела.,7

DS

DS 0,1

-S 3,1

Сыворотка крупного рогатого скота

В9

44,5

Результаты связывания антител штамма DS c различными нуклеазами приведены в таблице.

5 1497214 эндонуклеазы ядер лимфацитов периферической крови человека и крупного рогатого скота, гепатоцитов крыс, се- . лезенки мышей линий СВА, С57В/с

5 и BALB/ñ. МонАТ реагируют с эндонуклеазами клеточных ядер тимацитов линий

C57B/с и СВА и не реагируют с эндануклеазами тимуса мышей линии BALB/с.

При хроническом лимфолейкозе крупного 10 рогатого скота антитела связывают эндонуклеазу лимфоцитов селезенки в меньшей степени, а фермент лимфоцитов периферической крови в большей, чем в норме. Антитела не реагируют с

ДНК-азой I поджелудочной железы быка, щелочной форфатазой человека, а также с белками крови человека.

Продуктивная способность, Секреция монАт на 4-й день культивирования 10-20 мкг в 1 мл среды и 1-3 мг в 1 мл асцитической жидкости. Синтез антител оценивают гетерогенным иммуноферментным анализам, Стабильность продуцирования монАТ сохраняется на протяжении 30 пассажей в культуре и 5-6 пассажей на животных, если гибридома перевивается ..

Криокансервирование. Клетки штамЗО ма ресуспендируют в эмбриональной телячьей сыворотке, содержащей 12,57. диметилсульфаксида, в концентрации

3-4 10 .кл/мл, разливают в пластикоб с вые ампулы при 4 С. Затем клетки замораживают по программе — до

-40 С снижение температуры на

1 /мин, а затем до -196 С по

-10 С/мин. Размораживание: i мин ри 37 С. Клетки разводят в 10 мл полной среды и переносят в культуральный флакон. Жизнеспособность клеток rio включению трипанового синего 75-90Х.

Контаминация, Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длитель- 45 ном наблюдении и посевах на питательные среды.

100

14

0

DS (3,7 мкг/мл)

DS (25 мкг/ил)

Сыворотка крупного рогатого скота

1497214 зации, изучения распределения изоформ фермейта в лимфоидных органах человека, определения активности и содержания Са /Mg -зависимой эндонуклеазы при лимфопролиферативных ,заболеваниях.

Связывание антител штамма DS c

Ca /Mg -зависимой эндонуклеазой экстрактов клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека 100Х, мьппей 107 и крупного рогатого скота 457.

Использование штамма позволяет получать монАт высокой специфичности к Са /Mg -зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека„ которые могут быть-использованы как для количественного и качественного определения эндонуклеазы, так и для гистохимического исследова ния изоформ фермента, связанного с 15 изучением их внутриклеточной локали Формулаизобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П)

Ф 117Д вЂ” продуцент моноклональных антител к Са /Mg — зависимой эндонукД+ 2+ леазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.

Составитель Г.Смирнова

Техред М, Ходанич Корректор М.Шароши

Редактор Н. Киштулинец

Заказ 4406/29 Тираж 501 Подписное .ВННННН Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул . Гагарина, 101